百部总生物碱缓释片的质量标准研究△

吴旖，赵斌，江仁望

(1.中山火炬职业技术学院，广东 中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心 中山健康产品分中心，广东 中山 528436；3.暨南大学 药学院，广东 广州 510632)

·中药工业·

百部总生物碱缓释片的质量标准研究△

吴旖1,2*，赵斌1,2*，江仁望3

(1.中山火炬职业技术学院，广东 中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心 中山健康产品分中心，广东 中山 528436；3.暨南大学 药学院，广东 广州 510632)

目的：建立百部总生物碱缓释片的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法对百部总生物碱缓释片中对叶百部碱进行定性鉴别，采用固相萃取-高效液相-蒸发光检测法建立百部总生物碱缓释片中对叶百部碱的含量测定方法，并测定其体外释放度。采用蒸发光散射检测器，色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.12%三乙胺溶液(40∶60)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；进样量为30 μL；ELSD参数为漂移管温度97 ℃、空气流速为3 mL·min-1。结果：本品定性鉴别薄层色谱特征明显，专属性强。对叶百部碱的质量浓度为0.02～0.30 mg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为99.86%，百部总生物碱缓释片在2、8、12 h的累积释放度分别为10%～30%、50%～70%、80%～100%，均符合规定。结论：该分析方法简单、快速、准确、具有代表性，可作为百部总生物碱缓释片的质量控制方法。

百部；总生物碱；缓释片；高效液相色谱法；体外释放度

百部是一味具有镇咳活性的传统中药，始载于公元500年左右陶景洪编纂的《名医别录》。现在，百部仍然是镇咳复方中的常用中药。根据《中华人民共和国药典》2010年版一部收载[1]，百部为百部科植物直立百部Stemonasessilifolia(Miq)Miq.、蔓生百部Stemonajaponica(BL.)Miq.或对叶百部StemonatuberosaLour.的干燥块根。前期研究发现，百部生物碱是百部主要的镇咳活性成分[2]，镇咳有效部位BB-1(为总生物碱且不含金大刚碱等小毒成分)具有显著的镇咳活性[3]，与传统镇咳药相比，其可针对咳嗽的多种原因进行镇咳，具有高效、低毒的优势。目前，国内外对百部总生物碱药物制剂的研究未见文献报道，本研究在百部总生物碱缓释片工艺研究的基础上，采用SPE-HPLC-ELSD法[4]建立百部总生物碱缓释片中对叶百部碱的含量测定方法，并对其体外释放度[5]进行研究，为建立百部总生物碱缓释片的质量标准，有效控制制剂质量提供参考[6]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；2000蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)；DK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；ZRS-8G智能溶出仪(天大天发科技有限公司)；SB-5200DT超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BP61型电子天平(德国Satorius)；UPT-I-10T超纯水器(成都超纯科技有限公司)；恒温水浴锅(金坛市鸿科仪器厂)。

1.2 材料

百部总生物碱提取物由本课题组提取分离获得；对叶百部碱对照品由本课题组从对叶百部中提取分离获得；百部总生物碱缓释片(自制，批号分别为20141001，20141002，20141003)；乙腈为色谱纯(上海纯晶实业有限公司)；3 mL×500 mg固相萃取柱(美国色谱科技公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 对叶百部碱薄层色谱鉴别

精密称取对叶百部碱对照品适量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成对照品溶液。取10粒百部总生物碱缓释片，快速研匀后，精密称定1.0 g，加入50 mL 50%甲醇，超声溶解，过滤，滤饼用5 mL 50%甲醇洗涤，合并滤液和洗液，并转移至已处理好的C18固相萃取小柱中，先用5 mL水洗脱，再用5 mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，转移至25 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密量取甲醇溶液1.0 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。

依照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，分别吸取2.1中对照品溶液和供试液各2 μL，在同一硅胶G薄层板上点样，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(16∶4∶1)为展开剂，取出，吹干，再均匀喷上0.5%茚三酮溶液，150 ℃加热2 min，至斑点显色明显后，再置碘蒸气中熏至斑点清晰。见图1。在薄层板对叶百部碱斑点的相应位置上显相同颜色的斑点(为保证实验准确性，供试品平行点样3次)。

注：1～3.供试品；4.对照品。图1 百部总生物碱缓释片的TLC图谱

2.2 百部总生物碱缓释片的含量测定

本文根据前期研究发现，百部总生物碱中对叶百部生物碱含量高且稳定，可以作为百部总生物碱的一个代表性含量检测指标，所以在接下来百部总生物碱缓释片含量及释放度测定中均以对叶百部碱为代表物进行检测。

2.2.1 液相色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.12%三乙胺溶液(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：30 μL；ELSD参数：漂移管温度为97 ℃；空气流速为3 mL·min-1。

2.2.2 对照品及供试液的制备 对照品溶液的制备精密称取对叶百部碱对照品适量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为0.2 mg·mL-1的对照品储备液。

供试品溶液的制备：取10粒百部总生物碱缓释片，快速研匀后，精密称定1.0 g，加入50 mL 50%甲醇，超声溶解，过滤，滤饼用5 mL 50%甲醇洗涤，合并滤液和洗液并转移至已处理好的C18固相萃取小柱中，先用5 mL水洗脱，再用5 mL甲醇洗脱。收集甲醇洗脱液，转移至25 mL的容量瓶，甲醇定容至刻度，精密量取甲醇溶液1.0 mL，至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.22 μm的微孔滤膜即得供试品溶液。

阴性样品溶液的制备：按百部总生物碱缓释片的处方工艺，精密称取各辅料适量，按供试品溶液制备的方法制成阴性样品溶液。

2.2.3 方法学考察 专属性试验：取2.2.2项下对照品、供试品及阴性样品溶液各10 μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱，见图2。结果表明，样品中的辅料成分对测定无干扰。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性样品。图2 百部总生物碱缓释片的对照品、供试品、阴性样品高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取对叶百部碱对照品适量，配置成质量浓度为2 mg·mL-1的对照品溶液，分别精密移取0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，各精密吸取上述溶液及2.2.2项下对照品溶液40 μL，注入液相色谱仪中，测定，记录峰面积。对扫描积分值与进样浓度进行双对数直线回归处理，即以进样量的对数与峰面积积分值的对数作线性关系，得回归方程：Y=1.380 2X+5.799 9(r=0.999 7)。可见，进样浓度在0.02～0.30 mg·mL-1与积分值呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取对叶百部碱对照品溶液(0.2 mg·mL-1)30 μL，连续进样5次，测得5次峰面积积分值，峰面积积分值平均值为39 379 682，RSD=1.40%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液(批号：20141001)30 μL，分别于0、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积积分值，峰面积积分值平均值为38 958 241，RSD=1.20%，表明供试样品在24 h内稳定。

重复性试验：取样百部总生物碱缓释片(批号：20141001)6份测定，结果RSD=1.08%，表明该方法的重复性良好。

加样回收试验：取百部总生物碱缓释片(批号：20141001)粉末6份，约0.5 g，精密称定，分别加入对叶百部碱60 mg，按供试品制备方法制备得供试品溶液，测定计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收率结果(n=6)

含量测定：依2.2项下测定方法，对3批样品进行含量测定，结果见表2。

表2 对叶百部碱含量测定结果

2.3 体外释放度测定方法与结果

取百部总生物碱缓释片6片，按《中华人民共和国药典》2010年版(一部)释放度测定法，附录第一法(转篮法)操作，1.0%十二烷基硫酸钠溶液(SDS)800 mL作为释放介质，转速为100 r·min-1，温度为(37±0.5)℃，分别于2、4、6、8、10、12 h取样5 mL，30 s内用0.45 μm微孔滤膜过滤，同时补充等体积的同温介质。精密移取续滤液4 mL于10 mL具塞试管中，挥干溶剂，加入60%乙醇适量，溶解后摇匀，定容至10 mL。照2.2项下测定方法测定对叶百部生物碱含量，以对叶百部生物碱为代表物进行检测，并按下式计算缓释片的累积释放度：

Q=CnVt+Vs∑Cn-1

其中，Q表示缓释片累积释放度；Cn表示实测浓度；Vt表示溶出介质体积；Vs表示取样体积。

取3批百部总生物碱缓释片样品，测定在各时间点的体外释放度，结果见表3。

表3 3批样品的体外释放度测定结果(%)

根据《中华人民共和国药典》有关规定，百部总生物碱缓释片在2、8、12 h的累积释放度分别为10%～30%、50%～70%、80%～100%。结果表明，3批百部总生物碱缓释片的释放度验证结果均较理想，12 h的累积释药量均达95%以上，且重复性好，方法稳定、可行，表明该缓释片能达到很好缓释效果。

3 讨论

3.1 体外释放度测定方法的选择

百部总生物碱缓释片的凝胶骨架材料易吸水膨胀并产生较大粘性，易粘于杯底，故采用转篮法进行测定。

3.2 方法评价

百部总生物碱的含量测定方法已有文献报道的有2个：溴甲酚绿显色法和雷氏盐比色法。由于比色法自身的灵敏度低，并且样品制备过程中操作复杂，导致这两种方法的测定结果并不准确。HPLC-ELSD是近年来检测百部样品比较理想的分析方法。实验建立了制剂中对叶百部碱的薄层色谱鉴别方法，以对叶百部碱含量为评价指标，采用SPE-HPLC-ELSD法建立百部总生物碱缓释片中对叶百部碱的含量测定方法。运用此分析方法测定了3批百部总生物碱缓释片中对叶百部碱的含量，平均质量分数为120.18 mg·g-1。说明对叶百部碱在所测的3批缓释片中含量较为稳定，可以作为百部缓释片含量检测的一个代表性指标。同时运用此方法测定了百部总生物碱缓释片的体外释放度，说明该方法准确、简便、可靠，专属性、重复性好，可用于百部总生物碱缓释片的质量控制。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 彭蜀莹，沈建华，叶阳.4种百部生物碱的质谱行为研究[J].分析化学，2006，34：497-502.

[3] 吕丽华，叶文才，赵守训，等.直立百部的化学成分[J].中国药科大学学报，2005，36(5)：408-410.

[4] Zhang RongRong，Lu DanYi，Yang ZhenYa，et al.Simultaneous quantification of six alkaloid components from commercial Stemonae Radix by SPE-HPLC-ELSD[J].Phramacognosymagazine,2015，11(42)：360-367.

[5] Zhang RongRong，Tian HaiYan，Wu Yi,et al.Isolation and chemotaxonomic significance of stenine-and stemoninine-type alkaloids from the roots of Stemona tuberosa[J].ChineseChemicalLetters,2014，38(9)，1252-1255.

[6] 张亚中，薛玉梅，陶建生.百部生物碱的研究现状和思考[J].中成药，2008，30(2)：248-251.

StudyonQualityStandardofStemonaAlkaloidsSustained-releaseTablets

WUYi1,2*，ZHAOBin1,2*，JIANGRenwang3

(1.ZhongshanTorchPolytechnic，Zhongshan528436，China；2.Zhongshanhealthproductscenter，NationalEngineeringResearchCenterformodernizationoftraditionalChineseMedicine，Zhongshan528436，China；3.CollegeofPharmacyJinanUniversity，Guangzhou510632，China)

Objective：To establish the quality control standard for the total alkaloids sustained-release tablets.Methods：The total alkaloids in the Radix Stemonae sustained release tablets were identified by TLC，and the content of the total alkaloids was determined by SPE-HPLC-ELSD method，and also the release rate of the Stemona alkaloids was determined.The method parameters were as follows：Evaporative light-scattering detector；Chromatographic column：Agilent Zorbax Extend-C18(250×4.6 mm，5 μL)；Mobile phase：acetonitrile-0.12% triethylamine solution(40∶60)；Flow rate：1.0 mL·min-1；Column temperature 25 ℃；Sample quantity：30(including l；ELSD parameters：the drift tube temperature is 97 ℃；The air flow rate for 3 mL·min-1.Results：This product characterized obviously in TLC，and the specificity was strong.Tubero stemonine concentration with peak area over the 0.02-0.30 mg·mL-1range showed a good linear relationship.The average recovery rate was 99.86%，the accumulative release rate of total alkaloids sustained-release tablets were 10%-30%，50%-70%，80%-100%，respectively，at 2，8，12 h，which conformed to the stipulation.Conclusion：The analysis method is simple，fast，accurate and representative，which can be used as the quality control method of the total alkaloids sustained-release tablets.

Radix Stemonae；total alkaloids；sustained-release tablets；HPLC；invitrorelease

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.023

2015-11-25)

广东省新药创制重大专项(2013A022100029)；中山市社会发展攻关项目(2013A3FC0325)

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吴旖，副主任药师，研究方向：药物制剂的研究与开发；Tel：(0760)88291713，E-mail:52419050@qq.com