脑白质低灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达变化

秦　川　渠文生

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科　武汉　430030



脑白质低灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达变化

秦川渠文生△

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉430030

目的研究慢性脑白质缺血后星形胶质细胞和缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)的变化。方法原代培养星形胶质细胞，建立体外慢性缺氧模型；双侧颈总动脉狭窄法，建立慢性低灌注脑白质损伤小鼠模型；免疫荧光共染观察星形胶质细胞活化与Cx43表达。Western蛋白定量分析髓鞘相关指标髓鞘相关糖蛋白MAG，星形胶质细胞标记物GFAP和Cx43的表达。结果与对照组相比，细胞慢性缺氧7d后，星形胶质细胞明显增生活化，伴随Cx43表达水平明显上调。Westernblot发现，在慢性脑白质缺血过程中，MAG的表达逐渐降低，GFAP持续增高，Cx43表达明显上调。免疫荧光共标记可见，星形胶质细胞中Cx43表达上调，主要分布于胼胝体中央区。结论慢性脑白质缺血损伤过程伴随星形胶质细胞Cx43表达增加，Cx43可能成为临床治疗血管性认知障碍的新靶点。

缺血性脑白质损伤；星形胶质细胞；缝隙连接蛋白43

随着社会人口构成的老龄化，认知障碍疾病对人类健康造成的影响日益突出。血管性认知功能障碍(vascularcognitiveimpairment，VCI)是临床最常见的认知功能障碍类型之一。以小血管病和低灌注为主要病因，以皮质下多发腔隙性梗死和缺血性脑白质病变(Whitematterlesions，WML)为主要脑部损伤特点的皮质下缺血性认知功能障碍，是VCI的主要和常见亚型[1]。“白质神经血管单元”由神经元轴突、髓鞘、各种胶质细胞以及深部血管构成。其中，星形胶质细胞与各种胶质细胞形成广泛的网络合胞体[2]，，对维持“白质神经血管单元”的发育、分化和功能稳定具有重要作用[3-4]。然而，星形胶质细胞表达的缝隙连接蛋白conexin43(Cx43)是否直接参与脑白质损伤的病理过程尚不明确。本实验拟通过建立慢性低灌注所致白质损伤小鼠模型和原代星形胶质细胞慢性缺氧模型，研究小鼠在低灌注的不同时期星形胶质细胞激活增生情况与Cx43的表达改变，以期解释脑白质缺血缺氧改变所致的脱髓鞘改变与星形胶质细胞Cx43表达变化之间的关系。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂激光共聚焦荧光显微镜(日本Olympus公司)；恒温冰冻切片机(德国Leica公司)；牛血清白蛋白BSA、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；山羊抗MAG单克隆抗体(美国SantaCruz公司)；小鼠抗GFAP单克隆抗体、兔抗Connexin43多克隆抗体(美国Millipore公司)；组织细胞裂解液、FITC标记的羊抗小鼠IgG、Cy3标记的兔抗羊IgG、HRP标记IgG(美国Pierce公司)。

1.2动物分组与制作模型健康SPF级成年C57BL/6J小鼠30只，雄性，体质量24～29g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。遵循随机原则进行实验动物分组：假手术组(n=10)、术后1d组(n=10)、术后10d组(n=5)和术后1个月组(n=5)，其中假手术组、术后1个月组各5只与术后1d组、术后10d组用于Westernblot检测，假手术组和术后1个月组余5只用于免疫荧光检测。小鼠BCAS模型的建立：根据ShibataM报道的方法稍加改良[4]，双侧颈总动脉狭窄(bilateralcommoncarotidarterystenosis，BCAS)小鼠模型，用内径0.18mm的microcoil夹套小鼠双侧颈总动脉，可选择性损伤前额叶-皮层下白质，影响该神经环路，而无明显的灰质损伤。假手术组分离双侧颈总动脉后缝合颈部切口，不上弹簧圈。

1.3原代星形胶质细胞培养与体外模型建立参考文献报道[5]的方法稍加改良进行大鼠乳鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养。选取新生0～1d的SD大鼠，无菌条件下取脑，剔除软脑膜及血管；用眼科剪剪碎组织，直至成为1mm3的组织碎块；0.125%胰酶37 ℃条件下消化2min，含血清培养基终止消化；无菌巴氏管反复吹打为细胞悬液；直径200目筛网过滤；4℃离心 8min(800r/min)，弃上清；用全培养基(DMEM/F12培养基+20%胎牛血清)重悬细胞；接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，置于37℃、95%O2、5%CO2培养箱中培养；常规换液培养；实验所用细胞为传2代细胞。通过化学法建立体外慢性缺氧模型，基本方法为1MCoCl2诱导星形胶质细胞7d。

1.4样本采集与检测培养细胞在化学法缺氧干预7d后多聚甲醛固定。术后1个月麻醉取脑，行冠状面切片，厚度为10m，用于冰冻切片染色取相同位置的切片进行染色。染色主要步骤：4 ℃预冷的多聚甲醛溶液固定15min破膜液，室温孵育10～15min；10%BSA封闭液，室温封闭2h；添加稀释的一抗(1：200)，在湿盒内孵育过夜；添加稀释的二抗(1：200)，室温避光孵育1h；封片后观察。

术后3d、10d、1个月取脑，分离提取白质总蛋白，用于Western定量检测。基本步骤为：组织细胞裂解液裂解脑组织，测定调整蛋白浓度后，上样60μg蛋白，120V的恒压继续电泳90min，调整电流为250mA，4℃电泳转移120min；加入稀释的一抗(1：400)，4℃缓慢摇动过夜；二抗(1：1000)室温缓慢摇动1h；显色扫膜拍照。测量条带的OD值，以GAPDH为基准折算相对值，进行统计学分析。

2　结果

2.1慢性缺氧细胞的变化化学诱导7d后，原代星形胶质细胞慢性缺氧模型建立成功。通过免疫荧光共标记GFAP和CX43，缺氧模型细胞组与对照组(图1A)相比，可见缺氧的星形胶质细胞明显增生活化，胞体肥厚，细胞排列紊乱、密集，而Cx43表达水平明显上调(图1B)。

图1　慢性缺氧后星形胶质细胞活化和CX43表达A：对照组；B慢性白质缺血模型组。绿色荧光标记GFAP，红色荧光标记Cx43

2.2动物模型中相关蛋白的表达变化慢性低灌注所致白质损伤小鼠模型成功建立后，Westernblot检测发现，在慢性脑白质缺血过程中，髓鞘损伤标记物从BCAS第3d起表达明显降低，1个月时降至最低，降低趋势具有统计学意义。GFAP持续增高，缝隙连接蛋白Cx43表达明显上调(图2)。

图2　慢性脑白质缺血模型组相关蛋白的表达变化

2.3动物模型建立1月后星型胶质细胞表达CX43的变化通过免疫荧光共标记可见，与对照组(图3A1/A2)相比，慢性低灌注模型组GFAP的表达明显增高(图3B1)，伴随Cx43的表达增高(图3B2)，GFAP和Cx43共表达，表明慢性脑白质缺血1个月后，星形胶质细胞的增殖仍活跃，伴随Cx43的表达增高。Cx43表达上调，主要分布于胼胝体中央区，即白质损伤最严重的区域。

图3　慢性脑白质缺血1个月后的变化A：对照组；B慢性白质缺血模型组。绿色荧光标记GFAP，红色荧光标记Cx43

3　讨论

星形胶质细胞作为神经系统重要的支持细胞和辅助免疫细胞，其功能具有双面性。一方面，活化后肥大、增生的星形胶质细胞有助于保证缺血损伤后结构的相对完整，可维持神经纤维的营养，促进其再生；另一方面，过度增生的星形胶质细胞可产生大量氧自由基和炎性因子以及谷氨酸等兴奋性神经递质，加重局灶组织损伤，同时其产生的内皮素等还可诱导小胶质细胞炎性反应的进一步加重[2，5]。本研究通过免疫荧光双标技术和Western技术观察低灌注后不同时间点胼胝体中央区星形胶质细胞增殖的变化，发现小鼠白质区域(胼胝体中央部)星形胶质细胞活化增殖，1个月时星形胶质细胞增殖明显，活化的星形胶质细胞胞体肥大，轴突分支增粗浓密，与文献报道[4]相一致。伴随星形胶质细胞活化增殖，Cx43表达量明显上调，且在低灌注1个月后损伤最为明显。在离体慢性缺氧模型中，星形胶质细胞与Cx43也具有同样的变化趋势。这些结果提示星形胶质细胞活化伴随的Cx43表达增加，可能参与到白质损伤与修复的过程中。

髓鞘相关糖蛋白MAG是髓鞘受损额敏感指标，在各类白质损伤模型中其表达量均明显下调[4，6]。我们的结果发现随着低灌注时间延长，MAG表达量逐渐降低，到1个月时下降最为显著，与既往文献报道相一致[4]，与星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43表达上调呈负相关关系。文献报道称，脑缺血时星形胶质细胞缝隙连接可介导损伤信号分子(Ca2+，Glu等)在细胞间传播，导致损伤的扩大[7]。同时神经损伤导致的细胞外Ca2+降低及炎性因子释放，可激活星形胶质细胞半通道，释放ATP、谷氨酸。Glu、ATP相关信号通路诱发胶质细胞产生Ca2+信号，调控轴突传导，是参与缺血时白质神经元、少突胶质细胞及轴突损伤的重要因素[8]。由此我们推测若选择性抑制星形胶质细胞缝隙连接通讯的表达及功能可能可以通过减少ATP、Glu等兴奋性物质的释放，抑制损伤因子在胶质细胞网络合胞体内的异常传播而产生脑白质保护作用。这也是我们值得进一步探索的研究方向。

本研究发现缺氧后星形胶质细胞增生活跃和Cx43表达持续上调的动态变化，特点与髓鞘损伤变化相一致，为进一步阐明星形胶质细胞与Cx43在低灌注脑白质损伤病变过程中的具体作用提供了研究基础。

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(收稿2016-05-16)

国家自然基金，编号：81400977

渠文生，男，1982年3月出生，河南南阳市人，目前为同济医院神经内科主治医师，从事脑血管病相关研究。E-mail：qws0309@163.com

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1673-5110(2016)16-0044-03