艾燃烧生成物对ApoE基因敲除小鼠脑内神经递质5-HT、GABA的影响

王　昊　杨　佳　赵百孝　哈　略　刘耀萌　黄　畅　于梦芸　惠　鑫　和　蕊　韩　丽

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029)



艾燃烧生成物对ApoE基因敲除小鼠脑内神经递质5-HT、GABA的影响

王昊杨佳赵百孝哈略刘耀萌黄畅于梦芸惠鑫和蕊韩丽

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029)

目的：观察艾燃烧生成物即艾烟对载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)大脑内神经递质5羟色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(GABA)含量变化的影响。方法：本实验选用8周龄载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)21只，7只同龄相同遗传背景非转基因小鼠C57BL/6作为空白对照组。ApoE-/-小鼠随机平均分为艾烟组、模型对照组、氯吡格雷组。艾烟组小鼠5～15 mg/m3浓度艾烟干预，空白对照组和模型对照组小鼠空白抓取，氯吡格雷组口服给予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)，各组干预6 d/周，16周后牺牲动物，使用LC-MS/MS同时测定脑组织中神经递质GABA、5-HT含量。结果：艾烟组其脑内5-HT、GABA的含量显著高于模型组(P<0.05)，氯吡格雷组脑内5-HT与模型组无明显差异，GABA的含量显著高于模型组(P<0.05)，3组间均具有统计学意义(P<0.05)。结论：适当施灸时，一定浓度范围之内的艾燃烧生成物可以治疗性提高ApoE-/-小鼠脑内5-HT及GABA的含量。

艾燃烧生成物；ApoE基因敲除小鼠；神经递质；5-HT；GABA

艾灸是用艾叶制成灸材，点燃后通过热辐射刺激体表穴位或特定部位激发经气和通过呼吸吸入具有芳香气味的艾烟，共同调整人体生理功能，从而达到防病治病目的一种传统中医疗法。艾灸疗法的作用主要有温通经脉、升阳举陷、散寒祛湿、消肿散结、祛瘀通络、回阳救逆等作用，其保健强壮、鼓舞正气的效果较好，故该疗法广泛应用于日常养生。艾燃烧生成物即艾烟，可通过呼吸或皮肤吸收等途径进入人体[1]，其成分复杂，主要作用成分可能为桉油精、龙脑、侧柏酮、β-石竹烯等挥发油[2-3]，但目前仍尚未探明具体是哪种成分及其作用机制。

本课题组致力于艾灸及艾燃烧生成物作用机制的相关研究。在之前的研究中，我们发现艾烟具有抗氧化、光谱杀菌、抗病毒、抗肿瘤、调节脑内氨基酸类神经递质、减少血小板聚集、改善微循环[4]、保护海马CA3区、减少Aβ沉淀[5]等作用，从而改善小鼠学习记忆能力，进而起到延缓脑组织衰老，预防和改善阿兹海默病症状的作用。

ApoE载脂蛋白基因敲除(ApoE-/-)小鼠是由美国Rockefeller大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室于1992年采用胚胎干细胞基因敲除(gene knockout)技术培育成功，能够在自然膳食下形成严重的高脂血症，并自发形成纤维斑块和复合斑块，病理学改变与人类极为相似，因此广泛应用于动脉粥样硬化的研究中[6]。随着ApoE4与阿兹海默病(Alzheimer Disease，AD)间相关性的发现与逐步证实，ApoE-/-小鼠成为研究ApoE在神经系统内功能以及ApoE基因缺失后可能出现的神经功能障碍的最佳动物模型。研究发现ApoE-/-小鼠在受到缺血性损害后，神经细胞的损害更加严重，而给予植入ApoE基因后，神经损害又大大减轻，这进一步支持ApoE的神经保护功能[7-8]。ApoE-/-小鼠出现认知障碍与胆碱能神经功能障碍[9-11]，而这两者又是AD的主要特征，胆碱能神经受损被认为是AD认知功障碍的主要原因，因此ApoE-/-小鼠已经被作为一种新型动物模型，应用于研究ApoE缺失在乙酰胆碱神经损害所致认知障碍过程中发挥的作用[12]。刘钧天[5]证明了ApoE-/-小鼠可以作为阿茨海默病的动物模型,并说明艾烟的确可以降低ApoE-/-小鼠的脑内淀粉蛋白沉淀，改善其学习记忆功能，进而起到延缓脑组织衰老，防治AD的作用。

本实验选用ApoE基因敲除小鼠，观察艾烟干预对小鼠脑内神经递质5-HT、GABA含量变化的影响，探讨艾烟抗衰老的作用效应。

1　实验材料

1.1实验动物本实验选用8周龄载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)21只，7只同龄相同遗传背景非转基因小鼠C57BL/6作为空白对照组。小鼠均购自于北京大学医学部实验动物科学部。ApoE-/-小鼠釆用高脂饲料(北京维通利华实验动物有限公司提供,含15%猪油、2%胆固醇、0.05%胆酸)喂养,C57BL/6釆用常规饲料喂养。所有小鼠均可自由进食饮水；饲养环境温度为(22±2)℃，湿度为50%～60%左右。釆用人工控制室内照明，保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8：00)交替循环。

1.2主要仪器与试剂Q-Trap 5500型串联四级杆-离子阱质谱分析仪(美国Applied Biosystems公司)，Sorvall Legend Micro 17R微量离心机(美国Thermo公司)，超低温冰箱,日本三洋公司产，XS105S十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Gilson移液器(法国Gilson公司)。特制细艾条(φ0.5 cm×20 cm,河南南阳汉医艾绒有限公司)；小鼠固定笼(自制,圆柱形,底面直径5 cm,高10 cm)；带孔玻璃缸(自制,80 cm×80 cm×60 cm,顶层玻璃正中设有直径为5 mm的圆孔；光散射式数字粉尘测试仪(北京宾达绿创科技有限公司)。5-HT，GABA均购自美国Sigma公司，甲醇、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2　实验方法

2.1分组小鼠适应性饲养1周之后，将ApoE-/-小鼠按随机数字表法随机平均分为艾烟组、模型对照组、氯吡格雷组，每组7只，高脂喂养，空白组选用C57BL/6小鼠作为对照，普通饮食喂养。

空白组小鼠：釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，不予任何处理，每日抓取固定20 min；

模型组：釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，不予任何处理，每日抓取固定20 min；

艾烟干预组小鼠：釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，暴露于10～15 mg/m3艾烟环境下20 min；

阳性药组小鼠：釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，不予任何处理，每日抓取固定20 min；口服给予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)；

各组干预6 d/周，16周后牺牲动物，检测各项指标。

2.2干预方法模型组与空白组小鼠：分别用自制小鼠固定笼固定后放入玻璃缸内,不做其他处理，20 min后取出。

艾烟干预组小鼠：将调试好的粉尘测试仪置于玻璃缸中间,将小鼠用自制小鼠固定笼固定后放于玻璃缸内。点燃细艾条,从玻璃缸上方圆孔中将燃烧的一端插入，令艾烟充满玻璃缸。用粉尘测试仪测试其浓度达到预定范围10～15 mg/m3后(此过程艾条燃烧约15 s)，将艾条取出,迅速封闭圆孔。此后每隔3 min记录1次浓度数值，使数值保持在10 mg/m3左右。若数值高于15 mg/m3，可将上方玻璃盖稍微移动，令艾烟散去部分后迅速将盖子移回；若数值低于5 mg/m3，可再将点燃的艾条由圆孔插入,以补充艾烟。每次艾烟干预结束后,打开玻璃缸释放艾烟，并擦拭玻璃缸清除艾燃烧残留物，以便下次实验操作。

2.3取材在干预16周后，将所有小鼠处死，冰台上快速取脑。将取得的脑组织放入标记的冻存管中，液氮冻存数分钟后移入-70 ℃冰箱待检。

2.4指标检测脑样品称重后，彻底剪碎(约100下)；下丘脑中分别加入0.2 mL生理盐水，然后在冰浴中超声匀浆得脑匀浆液。取各脑匀浆液0.15 mL，加入0.3 mL冰冷的乙腈，混匀后于4 ℃放置30 min，然后于4 ℃低温离心(8 000 r/min，3 min)，取上清液200 μL，在其中加入10 μL内标，然后5 000 g低温离心10 min后取上清液在LC-MS上测试。

TSKgel Amide-80色谱柱(2.0 mm×15 cm，3 μm)，柱温35 ℃，流动相乙腈-15 mmol·L-1甲酸铵水溶液(pH5.5)(60∶40)，流速0.4 mL·min-1。质谱检测器采用电喷雾电离方式进行离子化，以正离子多反应检测(MRM)模式进行扫描，离子源及其他相关参数优化为喷雾电压4 500V，加热温度500 ℃，Gas1 50Psi，Gas2 70Psi。

3　统计学方法

4　结果

各组小鼠脑内神经递质5-HT和GABA含量比较见表1和图1、图2。

与空白对照组对比，模型组小鼠脑内5-HT、GABA含量明显下降，差异有统计学意义。艾烟组脑内神经递质5-HT和GABA含量介于模型组和空白组之间，显著高于模型组，P<0.01，差异有统计学意义。氯吡格雷组小鼠脑内5-HT和GABA含量略高于模型组，但差异无统计学意义，低于艾烟组，P<0.05，差异有统计学意义，见图1。

表1　各组小鼠脑内神经递质5-HT和GABA含量比较

注：与空白对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

5　讨论

中枢系统的5-HT神经元胞体主要集中在低位脑干的中线附近，称为中缝核群，向前投射至前脑，向两侧投射至新皮质的广泛区域，5-HT为单胺类神经递质。作为中枢神经系统重要的神经递质，其含量占全身总量的1%～2%，而脑内5-HT能神经递质在记忆功能中起着非常重要的作用，另外同样重要的还有胆碱能、儿茶酚胺能神经递质[13]。5-HT被认为可通过与脑内乙酰胆碱的交互作用直接与记忆发生联系。

图1　各组5-HT和GABA含量对比

GABA是一种重要的抑制性神经递质，正常的工作记忆功能取决于背外侧前额皮层适量的GABA的神经传递，GABA的过少和过多释放都会损害记忆[14]。衰老时GABA含量的下降可进一步造成机体的抗氧化能力减弱，继而引发一系列的病理生理变化，最终导致神经元的损伤、凋亡，出现记忆力下降、认知障碍、思维迟缓等脑老化的表现。

中枢神经系统是一个耗能高、耗氧高的高代谢系统，其本身又含有高浓度易于氧化的物质，这导致中枢神经系统极易受到氧化应激的损伤，脂质过氧化是最早的改变之一。杨秀丽[12]发现，ApoE-/-小鼠脑内的氧化性产物增多，其抗氧化系统受到明显的损害，这导致小鼠脑内氧化-抗氧化系统失衡，产生氧化应激，而这可能是最终导致小鼠认知功能障碍的根本原因。

本实验结果显示，使用艾烟处理小鼠后神经递质含量明显高于模型组，接近于空白组水平，说明其治疗效果良好，艾烟生成物即艾烟作为艾灸作用因素之一可有效提高脑内神经递质5-HT和GABA含量，起到延缓脑组织衰老的作用。本课题组之前的试验已证明艾烟可减少ApoE-/-小鼠的脑内Aβ蛋白沉淀[5]，降低GFAP蛋白在海马的表达水平[15]，改善学习记忆功能，其作用途径可能是艾烟中有效挥发油成分，被呼吸系统和皮肤的黏膜吸收，调节神经递质和脂质代谢，增强神经系统兴奋性，改善脑内氧化应激损伤和炎性反应，从而起到预防和改善阿兹海默病症状的作用。

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(2016-06-28收稿责任编辑：洪志强)

Effects of Moxa Smoke on Brain 5-HT and GABA in Apolipoprotein E-deficient Mice

Wang Hao, Yang Jia, Zhao Baixiao,Ha Lue,Liu Yaomeng,Huang Chang,Yu Mengyun,Hui Xin,He Rui,Han Li

(SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of moxa smoke (Artemisia vulgaris) on neurotransmitters 5-HT and GABA in the brain of apolipoprotein E-deficient mice (ApoEKO) and explore the antiaging effect of moxa smoke. Methods: Seven eight-week old C57BL/6 mice were collected as control group, and twenty-one eight-week old ApoEKO mice were randomly divided into 3 groups (n=7/group): model group, moxa smoke group, and clopidogrel group. Mice in the smoke group was exposed to smoke, whose concentration is controlled within 5～15 mg/m3; mice in model group and control group were exposed to normal air. Mice in clopidogrel group were treated with 14 mg/kg clopidogrel orally once/day. After 16 weeks interference, the levels of 5-HT and GABA in the mice brain were measured. Results: Compared with the model group, the brain 5-HT and GABA levels of moxa smoke group were decreased significantly (P<0.05). There is no significant difference between the clopidogrel group and control group in 5-HT concentration, while GABA level was higher in clopidogrel group with significant difference (P<0.05), besides, the differences among the three groups have significant difference (P<0.05). Conclusion: Within appropriate concentration, moxa smoke can obviously increase brain 5-HT and GABA levels in ApoEKO mice.

Moxa smoke; Apolipoprotein E-deficient mice; Neurotransmitter; 5-HT; GABA

国家自然科学基金项目(编号：81373730)；国家自然科学基金项目(编号：81574068)；国家青年自然基金项目(编号：81403449)；国家国际科技合作专项项目(编号：2011DFA31370)

王昊(1991.01—)，男，北京中医药大学2015级在读硕士研究生，研究方向：艾灸与艾燃烧生成物的效应机制，E-mail：wh_bucm@126.com

赵百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生导师，北京中医药大学针灸推拿学院院长，研究方向：艾灸作用与原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.005