青岛太平湾潮间带趋磁细菌多样性

徐　丛，张文燕，陈一然，张　蕊，董　逸，杜海舰，潘红苗，肖　天，*

1 中国科学院海洋研究所，海洋生态与环境科学重点实验室, 青岛　266071　　2 中国科学院大学, 北京　100049



青岛太平湾潮间带趋磁细菌多样性

徐丛1,2，张文燕1，陈一然1，张蕊1，董逸1，杜海舰1,2，潘红苗1，肖天1，*

1 中国科学院海洋研究所，海洋生态与环境科学重点实验室, 青岛2660712 中国科学院大学, 北京100049

在青岛太平湾潮间带沉积物中发现了一定量的海洋趋磁细菌，最大丰度可达350 个/cm3。透射电镜观察发现该区域趋磁细菌均为趋磁球菌。磁小体个体形状单一，皆是立方体状；磁小体排列方式多样，以链状排列为主，包括单链、双链与多链，也有少数成簇排列。EDS结果表明，磁小体成分为四氧化三铁。据估算，趋磁细菌的铁元素含量(干重)范围在0.40%—6.91%之间，平均为2.19%。通过16S rRNA基因文库的构建与测序得到了47个趋磁细菌序列，分属13个OTU。系统发育分析结果表明，它们都属于α-变形菌纲，其中9个OTU与已知最相似序列的相似性低于97%，有5个OTU与已知最相似序列的相似性低于93%，可能代表了趋磁细菌的9个新种、5个新属，说明该区域潜在的微生物新种质资源十分可观。

潮间带；趋磁细菌；多样性；磁小体；16S rRNA 基因

趋磁细菌(magnetotactic bacteria)是一类能够沿磁力线运动的特殊细菌[1]，其形态多样，有单细胞的球菌、杆菌、弧菌、螺旋菌以及多细胞趋磁原核生物[2]。趋磁细菌的趋磁性，源于体内含有的起导向作用的磁小体(magnetosome)与提供运动动力的鞭毛[3]。磁小体通常呈链状排列，有单链、双链以及多链，少数趋磁细菌的磁小体不成链排列[4-5]。磁小体的大小、形状以及成分都具有种属特异性[4-6]；磁小体个体大小为35—120 nm，处于稳定的单磁畴范围内[5-7]；形状有立方八面体、六面体棱柱、子弹头形、泪滴状、薄片状、球状以及不规则状等形态[7-8]；成分有四氧化三铁或/与四硫化三铁[2]。自1975年美国学者Blakemore在Science上报道了趋磁细菌之后[9]，科学家陆续从海洋、湖泊以及土壤等不同水陆生境中发现了趋磁细菌[2,10]。这些趋磁细菌属于变形菌门下的α-变形菌纲、γ-变形菌纲与δ-变形菌纲、硝化螺旋菌门以及Candidate division OP3[2]；在GeneBank中收录的趋磁细菌16S rRNA基因序列约有1200条(截至2014年6月)。在中国，趋磁细菌在多种生境被发现，这些生境主要分布在4个地区：北京的湖泊水库(北海、密云水库等)、西安湖泊河流(曲江池、护城河等)、山东半岛沿岸的海湾潟湖(胶州湾、汇泉湾、月湖等)以及海南岛八门湾[10-15]。在海洋环境中发现了形态相异、生理特点不同、分属不同分类单元的趋磁细菌[11-15]。本文收集了青岛太平湾潮间带沉积物中的海洋趋磁细菌，对趋磁细菌的形态、大小，磁小体大小、数目、排列方式以及16S rRNA基因系统发育做了研究，并对其与不同地域趋磁细菌群落构成作了比较。

1　材料与方法

1.1样品采集

采样点位于青岛黄海沿岸(36°03′03″N,120°21′09″E)太平湾潮间带的中潮带，每天都有时间裸露出水或浸没入水下。2014年3月份在采样点3次采集表层沉积物(0—10 cm)，分别装在500 mL的塑料采样瓶中，每瓶沉积物约100—150 g，之后向瓶中注入原位海水(沉积物与原位海水的比例约为1∶1)，带回实验室进行后续实验。

1.2趋磁细菌的收集

将磁铁粘在采样瓶的外壁，S极朝向收集瓶。30 min后，用巴斯德管吸取磁铁附近的样品约500 μL，注入100 mL螺口玻璃瓶中进行二次磁收，瓶中菌液约40 mL。使用相同方法对二次磁收瓶中的样品进行磁富集。之后采用“T-T”法进一步富集趋磁细菌[16]：将5 mL移液枪头的顶端插入无菌离心管中，离心管与移液枪头的顶端都注满0.22 μm过滤的无菌原位海水，将二次磁收集所得的菌液由移液枪头的粗端注入移液枪头的无菌原位海水中，置于匀强磁场(磁场强度约0.35 mT)，待离心管底端出现明显的灰色的菌斑，则停止收集。取离心管底端菌液进行显微观察与种类鉴定。

1.3计数、形态观察与磁小体成分测定

使用OLYMPUS BX51显微镜的微分干涉(Differential Interference Contrast，DIC)模式，悬滴法观察趋磁细菌并计数。将收集的菌液，滴在铜网上(北京中镜科仪技术有限公司)，用透射电镜(HITACHI H8100，中国海洋大学电镜室)对菌体与磁小体进行观察，包括趋磁细菌菌体形态、大小，磁小体形态、大小、数目及排列方式。用高分辨率透射电子显微镜(JEM2100，山东大学化学与化工学院结构成分测试中心)对磁小体成分进行分析。

1.4趋磁细菌遗传多样性分析

1.4.1制备DNA模板

取T-T方法收集的菌液，用DEPC水洗涤3次，以去除海水中的离子。而后用液氮与80 ℃水浴反复冻融3次，使细胞壁破碎、细胞内DNA溶出。

1.4.2对16S rRNA基因进行扩增

PCR参照Bosshard等的方法进行[17]。引物：27f(5′-AGA GTY TGA TCC TGG CTC AG-3′)与1492r(5′-GGT TAC CTI GTI AGG ACT T-3′)。PCR的反应条件是：94 ℃变性10 min后，94 ℃ 1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环25次，72 ℃延伸10 min。PCR扩增的产物利用浓度为0.1g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)回收PCR产物。

1.4.3连接、转化与克隆及DNA序列测定

将琼脂糖凝胶中回收的PCR产物连接到载体pMD18-T(Takara，Japan)上，转化入E.coliTop10感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，在含有X-gal、IPTG与氨苄青霉素的SOB固体培养基上培养感受态细胞。选择具有氨苄青霉素抗性的菌落，挑出少量菌体作为模板，用T载体的通用引物M13-47与RV-M进行菌落PCR。扩增产物通过浓度为1%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳，检验其是否为阳性。将阳性克隆交予南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，从而获得16S rRNA基因序列。

1.4.416S rRNA基因序列分析

将16S rRNA基因序列进行BLAST比对(http://www.ncbi.hlm.nih.gov)，得到与实验所得的各条序列相似性最高的已知序列。通过BioEdit软件进行相似性分析，以MEGA3.1软件的邻位相接法进行系统进化分析。

2　结果

2.1趋磁细菌的丰度

通过光学显微镜镜检计数，经计算沉积物中趋磁细菌丰度最高可达350 个/cm3。

2.2趋磁细菌的形态

通过透射电镜观察，发现太平湾的趋磁细菌为球形趋磁细菌与卵圆形趋磁细菌(图1)，菌体大小为(2.23±0.69) μm ×(1.84±0.47) μm(n=21)，宽长比为0.87±0.10(n=21)。

图1　透射电子显微镜下趋磁细菌的形态Fig.1　Morphology of magnetotactic bacteria based on transmission electron microscopyA：聚集在一起的多个趋磁球菌 Magnetotactic bacteria togethered in a cluster; B,D：具有四条磁小体链的趋磁球菌 Magnetotactic bacteria with four chains of magnetosomes; C：具有一条磁小体链的趋磁球菌 Magnetotactic bacteria with only one chain of magnetosomes; E,F：具有两条磁小体链的趋磁球菌 Magnetotactic bacteria with two chain of magnetosomes

2.3磁小体的多样性与成分

通过透射电镜镜观察，可以发现太平湾趋磁细菌的磁小体链排列方式多样，磁小体个数、大小差别很大。图2显示了数量占优的趋磁细菌中磁小体的各种排列方式。54%的趋磁细菌含有两条磁小体链，平行或成角度排列；仅具有一条磁小体链的趋磁细菌占18%，具有多条磁小体链与磁小体成簇排列的趋磁细菌各占14%。可以发现，具有多条磁小体链的趋磁细菌，其磁小体链大都是两两平行排列。透射电镜观察结果显示，每个趋磁细菌所含磁小体个数不等，数量介于7—43个。磁小体平均体积介于2.71×105—1.63×106nm3(假设磁小体为长方体)。EDS分析结果显示，磁小体化学成分为四氧化三铁，假设趋磁细菌含水量为85%，则本实验中趋磁细菌的含铁元素量(干重)范围在0.40%—6.91%之间，平均为2.19%(总铁元素质量/总细菌干重)。

图2　透射电子显微镜下趋磁细菌的不同磁小体排列方式Fig.2　Magneosomes organizing in different modes based on transmission electron microscopyA：单条磁小体链 One chain of magnetosomes; B：平行的两条磁小体链 Two parallel chains of magnetosomes; C：成簇的磁小体 Magnetosomes in a cluster; D：成角度的两条磁小体链 Two unparallel chains of magnetosomes; E：四条磁小体链 Four chains of magnetosomes

2.4趋磁细菌遗传多样性分析

2.4.1趋磁细菌16S rRNA基因序列测定

将扩增片段以pMD18-T作为载体连接到E.coliTOP10感受态细胞中，用T载体通用引物进行PCR扩增，得到135个阳性克隆。对这135个阳性克隆进行测序与比对分析，发现其中属于趋磁细菌的序列有47条，分属13个OTU(相似性<97%)，分别为：XCQD1-18、XCQD1-2、XCQD1-19、XCQD51、XCQD81、XCQD6、XCQD2-2、XCQD4-20、XCQD34、XCQD2-23、XCQD53、XCQD130、XCQD1-21。根据遗传多样性分析，有23条序列所代表的细菌属于OTU(XCQD1-18)，优势度达48.93%。属于OTU(XCQD2-2)、OTU(XCQD1-21)、OTU(XCQD1-2)、OTU(XCQD2-23)、OTU(XCQD130)的序列分别有6条、5条、2条、2条、2条，其余各OTU都只有一条。香农威纳群落多样性指数为2.64 nit，均匀性指数为0.71。

2.4.2趋磁细菌16S rRNA基因的系统发育分析

根据所得序列在NCBI数据库中Blast的比对结果，结合在BioEdit软件中进行比对得到的相似性，将得到的13个OTU序列与其相似性最高的序列以及已获得纯培养的趋磁细菌序列进行系统发育分析。

结果显示(图3)，本实验所发现的趋磁细菌OTU分别与Uncultured Magnetococcus sp. clone MRT130(EF371494)、Uncultured Magnetococcus sp. clone MRT97(EF371493)、Uncultured Magnetococcus sp.clone M-67(EF371491)、Uncultured Magnetococcus sp.clone M-52(EF371485)，Uncultured Magnetococcus sp.clone XSE-42(EF379385)、Uncultured Magnetococcus sp.clone 37(EU780681)、ncultured Magnetococcus sp.clone M-40(EF371486)，最为相似。相似情况见表1。

表1　GeneBank中与本实验所发现的OTU最相似的序列

图3　趋磁细菌16S rRNA基因序列的系统发生树(加粗的是本实验所获得的序列)Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence analysis (The sequences determined in this study is shown in bold)

在系统进化树上，13个OTU皆属于α-变形菌纲。根据Stackebrandt等[18]认为16S rRNA基因相似性大于97%属于一个种，小于93%—95%属于不同的属。对13个OTU相似性分析表明，其中有9个OTU(XCQD 1-18、XCQD 1-2、XCQD 1-19、XCQD 81、XCQD 6、XCQD 4-20、XCQD 34、XCQD 2-23、XCQD 53)与已知最接近的序列的相似性小于97%，可能是新的种；其中，又有5个OTU(XCQD 81、XCQD 4-20、XCQD 34、XCQD 2-23、XCQD 53)与已知最接近序列的相似性小于93%，可能是新的属。

3　讨论

青岛太平湾为南向半封闭海湾，海湾内无明显排污口，水质良好，底质为泥沙与砾石混合。该环境沉积物中趋磁细菌的丰度可达350 个/cm3，较已报道的一般环境中趋磁细菌的数量(103—104个/ cm3)低[19]，远低于Files等[20]报道的淡水环境沉积物中的趋磁细菌丰度(104个/cm3)。与紧邻的汇泉湾趋磁细菌的丰度(105个/cm3)[21]相比，仅相当于其1/300。

在多次富集的样品中，始终只能观察到一种形态类型的趋磁细菌——趋磁球菌。已有研究表明，无论是在海洋还是淡水生境中，趋磁球菌在数量上都是占优势的[22-27]。本调查发现趋磁球菌占绝对优势(>99%)。透射电镜下可以观察到磁小体的排列方式与数目各异。铁是地壳中含量第四大的元素，对几乎所有已知生物都是必需的。同时，铁循环也是生物地化循环的关键过程。趋磁细菌群落在铁循环与铁元素沉积过程中扮演重要角色[28-29]：趋磁细菌主动地吸收自然环境中的铁离子与亚铁离子，积累在铁硫化物或铁氧化物质的磁小体中[30]；当趋磁细菌死亡，磁小体中的铁元素一部分以离子的形式回到环境中，一部分沉淀到沉积物中去[31]；还有的铁元素被捕食者摄取，从而进入食物链[32]。趋磁细菌是地质微生物学和生物矿化作用研究的模式微生物[2]。一般地，铁元素占趋磁细菌干重的2%—3%，这个比例比其他生物高数个数量级[33]。林巍等[31]假设，50%湖泊、池塘、水库环境分布有趋磁细菌，且位于沉积物的最上层10 cm，每立方厘米的沉积物含有1000个趋磁细菌，每个趋磁细菌含20个磁小体，每个磁小体体积为1.25×10-4μm3，趋磁细菌的代时为12 h，则每平方千米湖泊趋磁细菌磁铁矿年产量为0.95 kg。本实验每立方厘米的沉积物含有350个趋磁细菌，每个趋磁细菌平均有磁小体18个，每个磁小体平均体积为8.02×10-4μm3，则每平方千米潮间带趋磁细菌可产生磁铁矿1.92 kg，在太平湾潮间带的铁元素循环可能起到重要作用。趋磁细菌丰度与每个细菌的磁小体个数都不及淡水，但由于磁小体平均体积较大，因此海洋潮间带单位面积年平均磁铁矿产量是淡水的估算值的2.02倍。本实验中，将磁小体质量以四氧化三铁计，以细胞含水85%计，估算出太平湾潮间带趋磁细菌平均含铁元素质量比为2.19%，与文献报道一致。此外，磁小体质量与趋磁细菌的菌体质量成明显的相关性(r=0.637，P=0.002<0.05)(图4)。推测在自然状态趋磁细菌菌体越大，就需要越多的磁性物质来帮助其感知地磁场以调节其运动。

图4　磁小体质量与细菌质量的关系(r=0.637，P=0.002<0.05)　Fig.4　The relationship between the mass of bacteria and magnetosome (r=0.637，P=0.002<0.05)

图5　太平湾趋磁细菌与汇泉湾趋磁细菌的系统发生树(加粗的是本实验所获得的序列)Fig.5　Phylogenetic tree of magnetotactic bacteria in Taiping Bay and Huiquan Bay based on 16S rRNA gene sequence analysis (The sequences determined in this study is shown in bold)

与邢素娥等[21]对青岛汇泉湾趋磁细菌的调查结果比较(图5,图6)，汇泉湾趋磁细菌分为8个OTU(6个OTU在2006年属于新发现)，其中有两个与太平湾趋磁细菌相同。两地趋磁细菌群落的Jaccard群落相似度指数为0.1053。Jaccard群落相似度指数取值范围为0—1，越接近于0，则群落相似性越低。太平湾与汇泉湾群落相似性指数仅为0.1053，说明两海湾虽然紧邻，且采样地点同属潮间带，但是趋磁细菌群落的种类构成差别显著。这可能与这两个海湾的环境紧密相关。首先，汇泉湾采样地处在青岛市第一海水浴场，人类活动比较频繁，对潮间带环境影响较大；太平湾的采样地不在海水浴场范围内，人类活动对该地影响较小。第二，汇泉湾有一城市雨水下水道排放口，对汇泉湾潮间带存在潜在的淡水输入与有机物补充。第三，汇泉湾海岸线平缓，而太平湾多有礁石与海岬分布，两地水文地质条件相异[34-36]。第四，对汇泉湾潮间带趋磁细菌的采集是在2006年秋季的11月，而对太平湾趋磁细菌样品的采集是在2014年春季的3月，群落演替与季节差异也可能是造成两地趋磁细菌群落组成差异巨大的重要原因。

图6　太平湾趋磁细菌与汇泉湾趋磁细菌群落组成相似性比较Fig.6　Comparison of magnetotactic bacteria communites in Taiping Bay and Huiquan Bay

与大西洋法国地中海沿岸两个潮间带的趋磁细菌群落的研究结果比较[37-38]。在Six-Fours-les-Plages潮间带(43°06′03″N, 5°49′20″E，受到联合国环境规划署的特殊保护的一个海滩，没有污染，环境良好)发现了球形、弧状、杆状、螺旋形的趋磁细菌，磁小体的形状有立方体形、子弹头形、棱柱形、八面体形，发现了12个趋磁细菌OTU，其中11个是新OTU(相似性<97%)。太平湾趋磁细菌菌体的形态与磁小体的形状较为单一，发现13个趋磁细菌的OTU，其中9个是新OTU(相似性<97%)。相比较，Six-Fours-les-Plages的趋磁细菌多样性更丰富。另一个法国地中海Gulf of Fos的潮间带(43°26′ N, 4°49′E)受石油精炼与钢铁冶炼活动的影响，在这里发现了球形、弧状、杆状的趋磁细菌，磁小体的形状仅有立方体形，仅发现4个趋磁细菌新OTU(相似性<97%)，说明环境的污染可能会影响趋磁细菌的多样性。

以上所述，不同环境和时间季节差异可能是造成不同潮间带地区趋磁细菌种类组成差异的原因，这表明趋磁细菌的多样性非常丰富，有必要对其进行更多的调查研究和资源收集，丰富海洋微生物资源库。

致谢：中国科学院海洋研究所夏青同学帮助统计；中国海洋大学姜明老师与山东大学马希骋老师帮助使用电子显微镜；徐剑虹老师帮助采样。

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Diversity of magnetotactic bacteria in the intertidal zone of Taiping Bay, Qingdao

XU Cong1,2，ZHANG Wenyan1，CHEN Yiran1，ZHANG Rui1，DONG Yi1，DU Haijian1,2，PAN Hongmiao1，XIAO Tian1,*

1KeyLaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalSciences，InstituteofOceanology，ChineseAcademyofSciences，Qingdao266071，China2UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China

Magnetotactic bacteria (MTB) are gram-negative motile prokaryotes that produce magnetosomes and can orient and migrate along the geomagnetic lines of force. They are ubiquitous in sediments and stratified water columns, distributed predominantly in the oxic-anoxic transition zone (OATZ). MTB comprise several morphological types, including cocci, rods, vibrios, spirilla, and multicellular magnetotactic prokaryotes. Usually, cocci are the dominant morphology. Variable phylogenetic relatedness of MTB has been confirmed on the basis of 16S rRNA genes. MTB can biomineralize iron oxide and/or iron sulfide magnetosomes. In most MTB, magnetosomes are organized in chain(s). In this study, we found a certain amount of MTB in the intertidal zone of Taiping Bay, Qingdao City, where the maximum abundance reaches up to 350 ind./cm3. Transmission electron microscopy revealed that all the MTB were magnetotactic cocci, with a size of (2.23 ± 0.69) μm × (1.84±0.47) μm and the width/length ratio of 0.87±0.10 (n=21). Fifty-four percent of the MTB contained two chains of magnetosomes, eighteen percent with one chain, fourteen percent with more than two chains and fourteen percent with cluster. All of these magnetosomes were prismatic mineral crystals. There were 7—43 (mean=18，n=21) magnetosomes in a cell and the volume of magnetosomes varied between 2.71 × 105nm3and 1.63 × 106nm3. Assuming that all the magnetosomes were magnetite, the percentage of Fe in MTB was 0.40%—6.91% (average 2.19%) and per square kilometer of intertidal zone produced 1.92 kg magnetite every year. This suggests that MTB may play an important role in the iron biogeochemical cycle in this area. Additionally, according to the statistics for each magnetotactic bacterium, we observed that the mass of magnetosome increased with the increasing mass of MTB (r=0.637，P=0.002 < 0.05). Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that 47 sequences of MTB belonged to 13 OTUs (XCQD1-18, 1-2, 1-19, 51, 81, 6, 2-2, 4-20, 34, 2-23, 53, 130, 1-21) and affiliated toAlphaproteobacteria. OTU XCQD1-18 containing 23 sequences had the highest dominance index (48.93%). In addition, 6, 5, 2, 2, 2 sequences belonged to OTU XCQD2-2, XCQD1-21, XCQD1-2, XCQD2-23, XCQD130, respectively. The other OTUs had only one sequence. Shannon′s diversity indexH′ of MTB in Taiping Bay was 2.64nit, and Species Evenness J′ was 0.71. Nine OTUs (XCQD 1-18, 1-2, 1-19, 81, 6, 4-20, 34, 2-23, 53) shared less than 97% 16S rRNA gene sequence similarity with the nearest known sequences, in which, five OTUs (XCQD 81, 4-20, 4, 2-23, 53) shared lower than 93%. It suggested that they represented 9 new species and 5 novel genera. Our results indicate that there were substantial potential microorganism resources in Taiping Bay. Compared to the MTB community in Huiquan Bay, a bay adjacent to Taiping Bay, here were two MTB OTUs discovered both in Taiping Bay and Huiquan Bay. Two MTB OTUs were shared. Jaccard similarity coefficient was 0.1053, indicating that although the two bays were close to each other, the MTB communities showed great differences. Comparison of the features of MTB in Taiping Bay with two French Mediterranean coasts, Six-Fours-les-Plages and Gulf of Fos, revealed that environmental factors may have a great influence on the diversity of MTB. It is assumed that community succession, seasonal variation, and environmental distinction may contribute to the low similarity between the MTB communities and features of different intertidal areas. Our results imply that further investigation on MTB in terms of their diversity is required.

intertidal; magnetotactic bacteria; diversity; magnetosome; 16S rRNA gene

国家自然科学基金项目(41276170， 41206150, 41330962)；国际海域资源调查与开发“十二五”项目(深海(微)生物资源勘探与资源潜力评价)(任务书编号：DY125-15-R-03)

2014-12-01; 网络出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: txiao@qdio.ac.cn

10.5846/stxb201412012380

徐丛，张文燕，陈一然，张蕊，董逸，杜海舰，潘红苗，肖天.青岛太平湾潮间带趋磁细菌多样性.生态学报,2016,36(14):4346-4354.

Xu C，Zhang W Y，Chen Y R，Zhang R，Dong Y，Du H J，Pan H M，Xiao T.Diversity of magnetotactic bacteria in the intertidal zone of Taiping Bay, Qingdao.Acta Ecologica Sinica,2016,36(14):4346-4354.