用酵母双杂交筛选与HIV Tat相互作用的宿主因子*

路艳芳，　刘为勇，　乔　龙，　汪　峰，　侯红艳，　孙自镛△

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1检验科 2肿瘤生物医学中心，武汉　430030



用酵母双杂交筛选与HIV Tat相互作用的宿主因子*

路艳芳1，刘为勇1，乔龙2，汪峰1，侯红艳1，孙自镛1△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1检验科2肿瘤生物医学中心，武汉430030

目的通过酵母双杂交试验筛选与HIV Tat蛋白相互作用的宿主因子。方法对构建的pGBKT7-tat进行自激活和半乳糖苷试验。运用酵母双杂交实验以HIV Tat作为诱饵，与人均一化基因库进行初筛。对筛选出来的阳性克隆进行测序分析。结果构建的pGBKT7-tat无自激活特性和细胞毒性，然后进行酵母双杂交试验。结果发现在DDO/X/A平板上出现47个阳性的蓝色斑点，在QDO/X/A平板上进行进一步筛选，对再次出现的8个蓝色斑点进行测序。在GenBank中对相互作用的人体基因进行BLAST分析，根据基因注释推测其在病毒与机体相互作用过程中可能发挥的作用。结果测出5个不同的基因，这5个不同的基因分别为羧肽酶N、酪氨酸磷酸酶受体M、ATP1B1、锌指蛋白MYM2和锌指蛋白MYM5。结论本研究新筛选出羧肽酶、酪氨酸磷酸酶受体和ATP1B1病程相关蛋白及两个锌指蛋白等5种功能蛋白与HIV Tat相互作用，为进一步研究HIV Tat蛋白功能提供依据。

酵母双杂交；HIV Tat；蛋白质相互作用；天然免疫；病毒复制

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病的主要病原体。自从1981年发现以来，目前已经成为危害人类生命健康的重大传染性疾病。HIV Tat是一个14 kD的蛋白质。它是一个重要的HIV毒力因子，在病毒基因的表达、复制、播散和疾病的进程中发挥重要作用。它不但可以通过反式激活效应参与病毒基因的复制和表达，还可以分泌到胞外，抑制免疫细胞的分化和增殖，诱导其凋亡，激活静止的CD4+T细胞，利于HIV的感染和体内传播[1]。研究HIV蛋白质间相互作用及与宿主蛋白相互作用对理解HIV的生命周期、感染机制等具有重大意义。

1　材料与方法

1.1材料

人均一化文库cDNA、酵母菌株Y2H gold菌株、pGADT7、pGBKT7等质粒购自Clontech公司、DH5α大肠埃希菌感受态细胞购自TaKaRa公司；酵母质粒小提试剂盒购自北京康为世纪公司；DNA聚合酶、DNA连接酶试剂盒、限制性内切酶Ndel1、Sal1，DNA纯化试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司；各种引物由上海生工合成，测序由擎科测序公司完成。

1.2实验方法

1.2.1诱饵载体pGBKT7-tat毒性及自激活检测采用醋酸锂法制备酵母菌Y2H Gold菌株感受态细胞并转化诱饵载pGBKT7-tat。涂布于单缺SD/-Trp平皿，30℃倒置培养5～7 d，挑取长势良好的单个菌落，扩增后提取酵母质粒转化大肠埃希菌JM110，以其为模板进行PCR鉴定。分析诱饵载体pGBKT7-tat是否成功转化至Y2H Gold菌株。挑取生长良好的菌落(直径=2～3 mm)接种于50 mL SD/-Trp并含有Kan+(卡那霉素,20 μg/mL)培养液的三角瓶中，30℃培养5、10、15、20、25和30 h后，用紫外分光光度计测定其A600nm，分析pGBKT7-tat对酵母菌生长的影响。将含有pGBKT7-tat重组质粒的酵母菌株Y2H Gold菌株涂布SD/-Trp、SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-Ade平板，30℃倒置培养5～7 d，观察平板菌落生长情况，分析pGBKT7-tat对酵母是否具有自激活活性。

1.2.2文库阳性克隆的初步鉴定平板倒置培养5～7 d，观察菌落在SD/-His/-Leu/-Trp平板的生长情况，挑取直径超过2 mm的白色菌落，接种于SD/-Ade/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上进一步筛选生长良好的蓝色菌落，参考酵母质粒提取试剂盒说明书提取质粒pGADT7载体。

1.2.3阳性克隆的测序和生物信息学分析舍弃插入片段小于500 bp的质粒，其余转化大肠埃希菌DH5α，以T7 5′-TAATACGACTCACTATAGG-GC-3′，CDS Ⅲ Primer-R 5′-GGCCGCCTCGGCCT-CTAGA-3′为引物进行测序PCR。由擎科测序公司测序。根据序列信息分析插入片段序列，在NCBI数据库进行BLAST分析，找到同源序列，统计序列长度、基因登录号、基因注释等信息。

2　结果

2.1重组诱饵载体pGBKT7-tat自激活及毒性检测

将pGBKT7-tat质粒转化酵母Y2H Gold菌株，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal平板，以含有pGBKT7-53质粒的酵母菌为阳性对照。阳性对照在三种缺陷型培养基上均能正常生长，且SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal培养基上菌落颜色变为蓝色，而诱饵载体只有在SD/-Trp平板能正常生长，诱饵载体自身不能激活报告基因His及Ade的表达，没有自激活活性。将含有质粒pGBKT7和诱饵载体pGBKT7-tat的Y2H Gold菌株分别进行培养，比较二者不同培养时间A600nm的差异，结果含有质粒pGBKT7的Y2H Gold菌株A600nm吸光度值分别为：0 h：0.008、5 h：0.008、10 h：0.043、15 h：0.250、20 h：1.045、25 h：2.101、30 h：2.434；含有pGBKT7-tat诱饵载体的Y2H Gold菌株A600nm值分别为：0 h：0.010、5 h：0.011、10 h：0.044、15 h：0.204、20 h：0.974、25 h：2.083、30 h：2.414。二者生长情况相似，证明诱饵载体对酵母菌没有毒性。

2.2酵母双杂交筛选HIV Tat与人cDNA相互作用的基因

在DDO/X/A平板上出现47个蓝色菌落，QDO/X/A平板上出现8个蓝色菌落。结果如图1所示。A图为在DDO/X/A平板上酵母双杂交结果。红色酵母菌落为阴性结果，没有出现相互作用的蛋白质，不能激活下游基因的转录，编码β-半乳糖苷酶，催化X-a-gel出现蓝色菌落；蓝色菌落为出现相互作用的蛋白质，能够激活下游基因的转录，编码出β-半乳糖苷酶，催化X-a-gel出现蓝色菌落。B图为在电子显微镜下观察到的结果。三叶草型和米老鼠头样为典型的两种不同类型的酵母相互融合。

A：在DDO/X/A平板上酵母双杂交结果；B：电子显微镜观察结果图1　酵母双杂交结果Fig.1 Yeast two-hybrid results

2.3HIV Tat相互作用人基因的PCR检测鉴定

提取在QDO/X/A平板上长出的蓝色菌落酵母质粒，将提取的质粒转入感受态大肠埃希菌。然后提取大肠埃希菌内的质粒，以T7、CDSⅢ为引物进行PCR检测，PCR产物在1%琼脂糖电泳100 V 20 min，结果表明插入片段大小在500～1 500 bp之间。由于部分阳性克隆未成功提取质粒或高级结构的存在导致PCR没有成功。其中2、5和8号条带过弱，导致测序失败。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。

从左至右依次为M：250 bp Marker、1：阴性对照和2、3、4、5、6、7、8和9号阳性菌落PCR检测结果图2　QDO/X/A平板上长出蓝色菌落的PCR检测Fig.2 PCR detection of blue bacterial colonies on QDO/X/A plate

2.4HIV Tat相互作用的人基因的测序比对分析

对PCR阳性的菌落测序结果在NCBI上BLAST进行比对，结果有5个成功测序结果，依次为酪氨酸磷酸酶受体M(PTPRM)、羧肽酶N(CPN2)、Na+，K+-ATPase β1亚单位(ATP1B1)、锌指蛋白MYM5(ZMYM5)和锌指蛋白MYM2(ZMYM2),见表1。

表1　HIV Tat为诱饵筛选到人基因信息表

3　讨论

HIV Tat不像其他的转录因子是DNA结合蛋白，它是一种RNA结合蛋白，能够从HIV RNA分子中识别特殊的结构域即TAR(反式激活因子反应元件)。在HIV转录的过程中起着十分重要的作用。在缺乏Tat时，整合后的病毒DNA转录效率很低。Tat与反式激活效应区TAR RNA相互作用，反式激活转录可将转录效率提高几百倍。因此Tat蛋白在HIV的转录过程中起着十分重要的调节作用。

本研究利用酵母双杂交系统，从人体均一化cDNA文库中筛选到与Tat相互作用的蛋白，通过生物信息学分析，羧肽酶、酪氨酸磷酸酶受体和ATP1B1病程相关蛋白及锌指蛋白5种功能蛋白可能在与病毒相互作用过程中起重要作用。

羧肽酶N(CPN)是一种在肝脏中合成分泌到血液中的血浆锌金属酶，由两个酶活性小单元(CPN1)和两个大单元(CPN2)组成，可以保护蛋白质免受降解。先前研究表明，CPN已经作为重要的监管炎症分子的重要调节者通过其剪切炎症分子如补体C3a、C5a的氨基酸精氨酸和赖氨酸[2-3]。CPN是羧肽酶大家庭的一员，通过仅仅剪切一个氨基酸，CPN就能改变活性和受体结合。其中许多剪切精氨酸和赖氨酸。因为高度保守的激活位点和羧肽酶的丰富功能，已经很难阐明CPN在疾病过程中的作用。未来基因沉默技术的使用可能最有助于理解CPN在体内的功能[4]。

酪氨酸磷酸酶受体M(PTPRM)，一种细胞的黏附分子，属于酪氨酸磷酸酶家族中的一员，参与同种抗原的相互作用[5]。有研究表明PTPRM是肿瘤的负调因子，与多种肿瘤的进程和侵袭有关，如结直肠癌和乳腺癌[6-7]。到目前为止，与病毒相关的研究暂无。

Na+，K+-ATPase β1亚单位(ATP1B1)，已证实与多种病毒蛋白有相互作用，并能影响病毒的复制。在甲型流感病毒时，其ATP1B1蛋白含量能明显升高；并且基因敲除ATP1B1后，能够抑制病毒的复制[8]。ATP1B1蛋白能与HCMV UL136蛋白相互作用[9]。也有研究表明用电转法将ATP1B1转入兔的肺组织能够加速肺部液体的清除[10]。但是，至于ATP1B1通过何种信号通路对病毒复制有影响，还有待进一步的研究。

锌指蛋白MYM2(ZMYM2)，又名ZNF198。是研究得最透彻的锌指蛋白成员之一。有研究表明其能在肝细胞复制和肝细胞转换时，蛋白水平下调，说明其在HBV引起的肝细胞癌的发病机制和肝细胞复制中具有重要意义[11]。

酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的非常有效的分子生物学手段，且在研究病毒与寄主相互作用方面被广泛应用[12-13]。本试验通过酵母双杂交技术初步筛选到与HIV Tat相互作用的5种不同功能宿主蛋白，可为深入探讨HIV tat在病毒侵染过程中及与宿主相互作用过程中的生物学意义提供依据。在后续的实验中，我们将对选定的重要蛋白进行再次相互作用及功能验证。

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(2015-12-02收稿)

Identification of Host Factors Interacting with HIV Tat Protein by Yeast Two-Hybrid System

Lu Yanfang1，Liu Weiyong1，Qiao Long2etal

1DepartmentofClinicalLaboratory，2CancerBiologyResearchCentre，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo identify host factors that interact with HIV Tat protein by using the yeast two-hybrid system.MethodsThe self-activation and galactose glucoside experiments were conducted in the constructed pGBKT7-tat vector.Then，the yeast two-hybrid assay was employed to identify human proteins that could interact with Tat protein of HIV by screening the homogenized cDNA library.The positive clones were thereafter sequenced.ResultsThe constructed pGBKT7-tat vector was found no self-activation and cell toxicity.The yeast two-hybrid analysis showed that there were 47 positive blue dots on the DDO/X/A plate.Further screening of the 47 positive blue dots on QDO/X/A plate showed eight blue dots，which were later sequenced.Blast analysis was performed on these gene in GenBank.Five different genes were found based on the gene annotation of which played an important role in the interaction of the virus and the host.They were PTPRM，CPN2，ATP1B1，ZMYM5，and ZMYM2，respectively.ConclusionCarboxypeptidase，tyrosine phosphatase receptor protein，ATP1B1 course-related protein，and two zinc finger proteins that can interact with HIV Tat were found in the study，which provides the basis for further research on the function of HIV Tat.

yeast two-hybrid；HIV Tat；protein interaction；natural immunity；virus replication

，Corresponding author，E-mail：zysun@tjh.tjmu.edu.cn

R373.51

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.009

*国家科技重大专项项目(No.2012 ZX10004207-004)

路艳芳，女，1991年生，博士研究生，E-mail：lucomeon@126.com