EGCG对哺乳期铅暴露仔鼠学习记忆能力和海马抗氧化损伤作用的影响*

赵林远，尹延彦，李　静，张小欢,蒋鸿琳,李文杰#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001　2)新乡医学院基础医学院 新乡 453003　3)河南科技大学第一附属医院临床营养科 洛阳 471000



EGCG对哺乳期铅暴露仔鼠学习记忆能力和海马抗氧化损伤作用的影响*

赵林远1)，尹延彦2)，李静3)，张小欢1),蒋鸿琳1),李文杰1)#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 4500012)新乡医学院基础医学院 新乡 4530033)河南科技大学第一附属医院临床营养科 洛阳 471000

表没食子儿茶素没食子酸酯；哺乳期铅暴露；仔鼠；学习记忆；抗氧化损伤

目的：探讨不同剂量的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对哺乳期铅暴露仔鼠学习记忆能力的修复作用以及海马组织抗氧化损伤作用的影响。方法：选取10只SPF级C57BL/6孕鼠，分为对照组(2只)和染铅组(8只)。染铅组孕鼠自分娩第1天至第20天经饮水染铅(饮用5 g/L的醋酸铅溶液)，对照组饮用蒸馏水，母鼠通过乳汁对F1代仔鼠染毒。染铅结束后，取40只染铅仔鼠分为低、中、高剂量EGCG干预组、染铅模型组，每组10只，10只未经染铅的仔鼠作空白对照，分别用不同浓度的EGCG溶液和生理盐水等体积灌胃21 d。用Morris水迷宫和抗氧化酶试剂盒分别检测仔鼠学习记忆能力和海马组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。结果：各组小鼠平均逃避潜伏期差异有统计学意义(P均<0.001)；与染铅模型组相比，中、高剂量EGCG干预组SOD、GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显降低(P<0.05)。结论：EGCG通过提高抗氧化酶(SOD和GSH-Px)活性拮抗铅暴露引起的氧化损伤，改善仔鼠学习记忆能力。

铅是一种广泛存在于自然界的对人体具有多器官多系统毒性的重金属污染物。婴幼儿神经系统尚未发育成熟，对铅的神经毒性最为敏感，可引起生长发育落后、学习记忆能力的下降[1-2]。氧化应激在铅的神经毒性机制中发挥重要作用，铅可诱导活性氧(ROS)的大量生成，抑制抗氧化酶活性，使机体氧化/抗氧化机制失衡导致机体氧化损伤[3]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是茶多酚中最主要的活性成分[4]，具有诸多易于健康的功效。在神经领域中研究[5]发现，EGCG通过抗氧化性、自由基清除、抗淀粉样变等机制拥有多功能的神经保护作用。哺乳期铅暴露可导致仔鼠学习记忆能力下降、抗氧化机制失衡，而EGCG对其是否有拮抗作用，目前尚未见报道。该研究旨在从抗氧化角度探讨EGCG对铅暴露仔鼠的神经保护作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器醋酸铅(洛阳市化学试剂厂)，EGCG(上海晶纯生化科技有限公司)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)两种抗氧化酶活性测定试剂盒和丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(南京建成生物有限公司)；AY120电子分析天平(日本岛津公司)，Morris水迷宫(北京硕林苑科技有限公司)，LDZ4-0.8台式离心机(北京医用离心机厂)，722S可见分光光度计(上海精密科学仪器公司)。

1.3小鼠学习记忆能力的测定仔鼠灌胃结束后，用Morris水迷宫测量仔鼠学习记忆能力。将小鼠头朝池壁放入水中，取东、南、西、北4个起始位置之一作为放入点，从小鼠入水开始，记录其找到目标平台并在平台上停留3 s 后的时间(即逃避潜伏期)。训练过程中设置记录时间为120 s，若小鼠在此时间内找不到平台，则将其放上平台适应10 s，再进行下一次实验。实验历时4 d，每d训练4次，每次间隔1 h，取4次结果的平均值。自动录像系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径。

1.4样品的采集和保存在水迷宫结束后次日，对小鼠禁食，在麻醉状态下用摘除眼球法采集血液，放入含抗凝剂的冻存管中，断头处死小鼠，剥离脑组织并称量全脑重量，在冰上快速分离出海马，用冰生理盐水冲洗、滤纸拭干所有样品，均放于-80 ℃冰箱保存。

1.6海马组织氧化应激相关因子的测定SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法，GSH-Px与硫代巴比妥酸(TBA)缩合形成红色产物的方法测定GSH-Px活性,MDA含量测定采用TBA法。将海马组织加入预冷的生理盐水中研磨成组织匀浆，以3 000 r/min 离心10 min(离心半径为8.56 cm),取上清液按照试剂盒要求进行测定。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0进行分析处理，各组小鼠体重和平均逃避潜伏期的比较用重复测量数据方差分析，其他变量采用单因素方差分析的方法，组间两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1EGCG对哺乳期铅暴露仔鼠体重及脑质量和脏器系数的影响结果见表1。

表1　各组小鼠体重及脑质量和脏器系数的比较

小鼠体重：F组间=735.061，F时间=9.785，F交互=54.020，P均<0.001；脑质量：F=35.087,P<0.001；脏器系数：F=9.126,P<0.001；*:与空白对照组比较，P<0.05;#：与铅暴露模型组比较，P<0.05。

2.2小鼠Morris水迷宫测试结果见表2。

表2　各组小鼠水迷宫逃避潜伏期比较　s

F时间=216.992，P<0.001；F组间=19.004，P<0.001；F交互=1.246，P=0.056。

2.3EGCG对仔鼠血铅含量和海马氧化应激相关因子的影响结果见表3。

表3　EGCG对仔鼠血铅和海马组织氧化应激相关因子的影响

*:与空白对照组比较，P<0.05;#：与铅暴露模型组比较，P<0.05。

3　讨论

重金属铅暴露在不同的生命阶段会产生不同程度的毒害作用。在大脑快速生长发育的婴幼儿时期，长期低水平接触铅会造成中枢神经系统不可逆的功能障碍，并且这种改变会持续到成年阶段[6]。海马是学习记忆的关键部位，铅在人体内选择性地蓄积在海马部位，对海马本身结构和功能影响较大，抑制长时程增强效应[7]。研究[8]表明，氧自由基的大量产生及细胞脂质过氧化损伤在铅的毒性机制中发挥重要作用，而EGCG对神经细胞的保护作用主要在于能够清除自由基、铁离子螯合剂，提高抗氧化酶活性的功能。He等[9]研究发现，对于D-半乳糖诱导的老年痴呆小鼠模型，给予EGCG腹腔注射可以明显改善小鼠空间学习记忆能力及海马组织氧化应激水平，这提示EGCG可通过抗氧化机制来改善老年动物模型的学习记忆能力。

血铅是反映机体铅暴露水平及铅对机体健康影响的重要指标[10]。该研究结果表明，母鼠哺乳期铅暴露可致仔鼠血铅含量升高，仔鼠哺乳期染铅组(铅暴露模型组和EGCG干预组)与非染铅组(空白对照组)相比，血铅含量较高，而低、中、高EGCG干预组血铅含量较铅暴露模型组有所减少，但与空白对照组相比依旧很高，提示EGCG对铅毒的拮抗作用并不是通过驱铅来完成的，这与尹述婷[4]的研究结果一致。脑重量是反映幼年脑组织生长发育的重要指标，国内外许多研究[11-12]表明铅可减轻新生鼠脑重量，影响脑发育。作者对哺乳期铅暴露小鼠进行不同剂量的EGCG干预3周之后，对仔鼠脑进行称重，结果显示铅暴露模型组与空白对照组相比脑组织重量明显减少，差异有统计学意义，高剂量EGCG干预组与铅暴露组脑质量相比差异有统计学意义。以上结果提示，EGCG可明显改善铅暴露对脑组织的发育抑制作用，这与以往的研究[12]结果相似。

Morris水迷宫结果显示，与空白对照组相比，铅暴露模型组和EGCG干预组逃避潜伏期明显延长；与铅暴露模型组相比，干预组逃避潜伏期随着干预剂量的增加，学习记忆能力逐渐增加，提示哺乳期铅暴露可致仔鼠学习记忆能力降低，而EGCG干预可拮抗铅对仔鼠认知和学习记忆能力的损害。

SOD和GSH-Px是体内重要的两种抗氧化酶，SOD可与自由基反应产生过氧化氢，GSH-Px能特异性催化还原性谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的分解作用，这两种酶活性间接反映了机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化的终产物,而含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[13]。该研究结果显示，与空白对照组相比，铅暴露模型组仔鼠海马抗氧化酶活性(SOD和GSH-Px)明显降低，MDA含量则明显升高，这与国内外报道[14-15]基本一致。与铅暴露模型组比较，EGCG干预组SOD和GSH-Px酶活性明显提高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义。以上结果提示EGCG可提高脑组织内抗氧化酶活性，拮抗铅暴露引起的脂质过氧化损伤，改善仔鼠学习记忆能力，具体机制有待研究。

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(2015-11-28收稿责任编辑李沛寰)

Effects of EGCG on learning and memory performance and antioxidative injury ability in lead exposed offspring mice during lactation

ZHAOLinyuan1),YINYanyan2),LIJing1),ZHANGXiaohuan1),JIANGHonglin1),LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,PublicHealthCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)CollegeofBasicMedicalSciences，XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang4530033)DepartmentofClinicalNutrition,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471000

epigallocatechin gallate;lead exposed during lactation;offspring mice;learning and memory;antioxidative injury

Aim: To explore the effects of epigallocatechin gallate(EGCG)on spatial learning memory performance and antioxidative damage ability in lead exposed offspring mice during lactation. Methods: A total of ten healthy pregnant C5BL/6 mice were randomly allocated into control group and lead exposed group, which were treated with drinking double evaporated water and Pb containing water, respectively from the beginning of offspring birth and lasted until weaning. There were 2 pregnant mice in control group and 8 pregnant mice in lead exposed group. The offspring mice were exposed to lead by maternal milk. Forty lead exposed offspring mice and ten control offspring mice were employed as the research objects. According to the body weight,the mice were stochastically allocated into five groups: lead exposed group(normal saline),low,middle,high dose EGCG interfering groups and control group(ten control offspring mice) and each group was administered for by lavage 21 d.The spatial learning and memory ability was evaluated by Morris water maze,SOD and GSH-Px activity levels and MDA level in hippocampus tissue were measured by corresponding kits. Results: The escape latency in each group measured at different days had significant differences and there were also differences between different groups(P<0.001); the activity levels of SOD and GSH-Px were higher in middle，high interfering groups than those in lead exposed group, while the content of MDA was lower(P<0.05). Conclusion: EGCG may protect offspring mice from lead-induced peroxidation and enhance the spatial learning and memory ability through improving antioxidant enzymes activity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.011

*国家自然科学基金资助项目81172716

，男，1965年5月生，博士，教授，研究方向：营养相关慢性病，E-mail:lwj@zzu.edu.com

Q946.1