鸡六种病毒多重PCR检测方法的建立和应用

吴　静，赵润鹏，徐雪维，王　婉，杨小康，胡　东

(1.安徽理工大学医学院免疫与检验教研室，安徽　淮南　232001；2. 安徽理工大学免疫与感染研究所，安徽　淮南　232001)



鸡六种病毒多重PCR检测方法的建立和应用

吴静1,2，赵润鹏1，徐雪维1，王婉1，杨小康1，胡东1,2

(1.安徽理工大学医学院免疫与检验教研室，安徽淮南232001；2. 安徽理工大学免疫与感染研究所，安徽淮南232001)

禽流感(Avian influenza, AI)、鸡新城疫(Newcastle disease, ND)、鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis, IB )、鸡传染性喉气管炎( Infectious laryngotracheitis, ILT)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和鸡减蛋综合症(Egg drop syndrome 76,EDS-76)是6种常见的禽类病毒性传染病，给养鸡业造成重大经济损失。依据NCBI核酸数据库中禽流感病毒(Aiv)、新城疫病毒(Ndv)、鸡传染性支气管炎病毒(Ibv) 、传染性法氏囊病(Ibdv)、鸡传染性喉气管炎病毒(Iltv)及减蛋综合征病毒(Edsv)基因序列, 设计了6对特异性引物, 建立并优化针对鸡Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的多重PCR鉴别诊断方法, 同时进行现场检测应用。结果显示该多重PCR体系检测限为100fg，与其他常见病原体无交叉反应。研究表明鸡六种病毒多重PCR方法具有较高敏感性与特异性，在禽类常见病毒现场诊断方面具有广阔的应用前景。

多重PCR; 禽流感病毒; 新城疫病毒; 鸡传染性支气管炎病毒; 鸡传染性喉气管炎病毒

禽流感( Avian influenza, AI)、鸡新城疫( Newcastle disease, ND)、鸡传染性支气管炎( Infectious bronchitis, IB )、鸡传染性喉气管炎( Infectious laryngotracheitis, ILT)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和鸡减蛋综合症(Egg drop syndrome 76,EDS-76)是6种常见的禽类病毒性传染病，给养鸡业造成重大经济损失[1-3]。早期快速诊断对于控制疫情具有重要意义。多重PCR能够同时检测多种病原体，可对混合感染进行鉴别诊断，并且较之于血清学诊断、病原分离鉴定等常规诊断方法，具有快速高效，灵敏度高的优势。但已报道的多重PCR体系仅能对三种禽类RNA病毒进行检测，限制了该技术的临床应用[4]。本实验建立了可同时对上述6种禽类病毒进行鉴别诊断的多重PCR体系, 并对自然感染的病鸡进行了现场检测。

1　材料与方法

1.1毒株

禽流感病毒( Aiv)重组禽流感病毒灭活疫苗H5N1亚型购自青岛易邦生物工程有限公司；鸡传染性喉气管炎病毒( Iltv)活疫苗株购自梅里亚动物保健有限公司；新城疫病毒( Ndv )La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒( Ibv) H120株、鸡传染性法氏囊病毒(IBD)疫苗株、鸡减蛋综合症(EDS-76)标准毒株AV-127、禽呼肠孤病毒( ARV )及禽腺病毒( ADV)均由浙江农业科学院提供。大肠杆菌、沙门氏菌与副猪嗜血杆菌由我室保存[5-6]。

1.2主要试剂

Trizol Reagent RNA提取试剂盒购Invitrogen公司；TIANamp Genomic DNA Kit购自TIAN GEN公司；DNA琼脂糖胶回收试剂盒购自广州捷倍斯生物科技有限公司；rTaq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、反转录酶(AMV)、随机引物(9 mer)、dNTP(10 mmol/μL)和DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司。无菌PBS( pH7. 2) 自行由DEPC水配置。

1.3引物的设计与合成

于NCBI核酸数据库检索目的基因序列，Primer Premier 5软件设计6对能同时扩增上述6种鸡病毒的特异性引物(见表1)，采用NCBI-BLAST工具验证引物特异性。引物由上海生工公司合成。

表1　多重PCR扩增Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv及Edsv的引物序列

1.4病毒核酸的提取和cDNA合成

严格按照TIANamp Genomic DNA Kit说明书提取Ibdv、Iltv、Edsv和ADV的基因组DNA，置于-20 ℃保存备用[7]。根据Trizol Reagent RNA提取试剂盒说明书提取Aiv、Ndv、Ibv和ARV的总RNA，并立即反转录合成cDNA，反应条件：采用20 μL的cDNA合成体系，Aiv、Ndv或Ibv的总RNA样品2 μL，分别加入5×RT缓冲液4 μL,Random primer(9 mer ) 1 μL，dNTP (2.5 mM) 8 μL，RNA酶抑制剂( 40 U/ μL) 0.5 μL，AMV 2μL，DEPC水补足20μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25 ℃ 10 min、42 ℃ 60 min、99 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min的程序进行一个循环，cDNA合成后进行PCR扩增或-20 ℃保存备用[8]。

1.5多重PCR反应条件的优化与特异性实验

紫外吸收法测定病原模板D260 nm/D280 nm值进行核酸定量，以无菌超纯水调整至100 ng/μL。将Aiv、Ndv、Ibv的cDNA和Ibdv、Iltv、Edsv的DNA以等浓度混合，在不同的引物比例、引物浓度、Taq DNA聚合酶及退火温度的条件下进行多重PCR反应，以确定最佳的PCR反应条件。

1.6多重PCR的特异性和敏感性试验

在确定的最佳PCR反应条件下，对单个及混合病原模板进行扩增，并通过对大肠杆菌、沙门氏菌与副猪嗜血杆菌菌液、ADV的DNA、ARV的cDNA分别进行多重PCR，检测该多重PCR体系的特异性[9-11]。将上述等浓度混合的cDNA∕DNA以无菌超纯水稀释至各病原模板浓度均1ng/μL，再进行10倍系列浓度稀释得到1ng/μL～10 fg/μL的7个质量浓度，进行多重PCR扩增以检测该多重PCR的敏感性。

1.7多重PCR对自然感染鸡样品的检测

在无菌条件下采取送检的具有相关症状病鸡的肺、气管、脾、子宫及法氏囊组织, 加入5倍体积的PBS，剪碎研磨, 反复冻融3次, 3 000 r/min 离心10 min, 取适量上清液, 进行RNA或DNA抽提。同时收集病鸡的喉气管棉拭子，置于适量PBS充分振荡洗涤，室温静置10 min，待大块状物下沉后，将棉拭子吸带的液体在壁上尽量挤干，弃去棉拭子，3 000 r/min离心10 min，取沉淀用于RNA或DNA提取。抗凝血样本4 000 r/min离心10 min，吸取上清沸水浴15 min，自然冷却后作为扩增模板。然后使用建立的多重PCR方法进行Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的检测[12]，扩增产物以DNA琼脂糖胶回收试剂盒回收并进行基因测序。测序结果在NCBI网站检索比对以确定病毒种类。

2　结果

2.1多重PCR反应条件的建立

多重PCR通过退火温度、引物浓度和Taq酶浓度等的优化以后, 确立最佳的反应条件如下: cDNA 合成( 25 μL体系) : RNA样品2 μL, 5×RT缓冲液4 μL,Random primer(9mer ) 1μL,dNTP (2.5 mM) 8μL, RNA酶抑制剂( 40 U/μL) 0.5 μL, AMV2μL,DEPC水补足20μL。合成程序:25 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。PCR扩增(50 μL体系) : 10×PCR 缓冲液( Mg2+Plus) 5μL, rTaq DNA聚合酶0.5 μL( 5U /μL), dNTP混合物(10mmol/Leach) 1μL , 100 pmol/ μL的Ibdv、Iltv和Edsv上、下游引物各1.2 μL, 100 pmol/μL的Aiv、Ndv与Ibv上、下游引物各0.8 μL, cDNA/ DNA混合模板18μL, 用超纯水补足总体积至50μL。扩增程序为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s, 50 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1min, 35个循环; 72 ℃终延伸10 min, 4 ℃结束反应。取5 μL PCR产物加入1 μL 6×Loading buffer混合，经20 g/L琼脂糖凝胶120 V电泳40 min，GelRed染色，凝胶成像系统下观察并照相记录结果。

2.2多重PCR的特异性和敏感性试验

建立的多重PCR体系对6种目的病毒的单个及混合模板在最佳条件下进行扩增，得到的条带分子量均与预期相符，分别为679bp(Ibdv)、497bp(Ibv)、427bp(Iltv)、289bp(Edsv)、268bp(Aiv)和136bp (Ndv)。混合模板扩增的产物条带清晰，亮度相近(见图1)。在相同条件下，以Aiv的cDNA作为阳性对照，以无菌超纯水作为阴性对照，对其他动物病原模板进行扩增时未见阳性结果(见图2)。敏感性试验结果显示, 建立的多重PCR体系至少能同时扩增单种浓度为100 fg/μL的目的病毒模板(见图3)。

M : DNA Marker; 1: Ibdv; 2: Ibv; 3: Iltv; 4: Edsv; 5: Aiv; 6: Ndv; 7: Ibdv; 2: Ibdv+Ibv+Iltv+Edsv+Aiv+Ndv. 图1　Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的多重PCR检测

M: DNA Marker; 1: Aiv; 2: H2O; 3: Arv; 4: Adv; 5:E.coli; 6: Salmonella; 7: Haemophilus parasuis图2　对照病原模板检测多重PCR体系的特异性

M:DNA Marker;1: 1ng/μL；2: 100pg/μL；3: 10pg/μL；4: 1pg/μL；5: 100fg/μL；6: 10fg/μL.图3　多重PCR体系的灵敏度检测

2. 3多重PCR对自然感染鸡样品的检测

使用该多重PCR体系对送检的具有呼吸道症状、腹泻、蛋壳变化等症状的病鸡, 进行Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv检测。结果表明, 从送检的鸡血液、组织器官及喉气管棉拭子样本中检测到单一Ndv、Ibv、Iltv和Edsv以及混合病毒感染, 但没有检测到Aiv与Ibdv的感染(见图4)。测序结果与Nucleotide登录序列BLAST显示，Ndv鉴定株与Nucleotide中Ndv SG/Liaoning/2009， chicken/Shandong/N2/2008等同源性为99%，Ibv鉴定株与GenBank中Ibv isolate India/NMK/72/IVRI/10株同源性为94.8%。Iltv鉴定株与GenBank中Iltv, U.S. field isolate 632, chicken 99.2%。Edsv鉴定株与Eggdrop syndrome-1976 virus hexon protein (L3 II) genes同源性为100%。

M : DNA Marker; 1: Ibv; 2:Iltv; 3:Ibv﹢Edsv; 4:Ndv; 5: Edsv.图4　多重PCR体系对临床样品的检测结果

3　讨论

病毒感染在养鸡业较为常见，尤其是Aiv、Ibv、Ndv、Ibdv、Iltv及Edsv感染，一直对养鸡业的发展造成严重的危害。这6种禽类病毒传染性强，易于出现爆发性感染和混合性感染。Aiv、Ibv、Ndv、Iltv属于呼吸道病毒，病理变化和临床特征均十分相似，实际工作中难以区分[13]。Edsv感染在临床上仅以产蛋量突然下降以及产蛋质量异常为特征，无其他明显的临床症状与剖检病变，极易与其他病毒感染引起的产蛋下降相混淆[14]。Ibdv具有杀淋巴细胞性而导致鸡群免疫抑制，并发其他病原的混合感染。常规的检测方法难以对此6种病毒进行快速高效的鉴别诊断, 影响了临床及时有效的采取控制疫情的措施，制约了养禽业的发展。本试验建立的多重PCR体系可对以上6种家禽病毒进行快速的种别鉴定, 为此种疫情的防治、控制和扑灭提供了技术支持。

多重PCR技术的反应体系较常规PCR有较高的要求。我们在对本研究中的每种待检病毒进行普通PCR检测成功的基础上，不断调适引物比例、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度等实验参数，确定了最为合适的检测条件。各待检病毒在相应体系中均能扩增出目的基因片段，显示了该体系的特异性。同时，该多重PCR体系至少能同时扩增单种浓度为100 fg/μL的目的病毒模板, 表明其具有较高的敏感性。另外，本方法还显示对其他物种DNA的抗干扰能力，在该体系以大肠杆菌、沙门氏菌与副猪嗜血杆菌菌液、ADV的DNA、ARV的cDNA为对照模板进行扩增的实验中，均未显示阳性结果。从标本RNA∕DNA提取、RNA的逆转录、PCR反应到凝胶电泳结束，可以7h内完成，能够对6种临床多见或正逐渐增多的病毒进行快速准确鉴定，显示本方法具有较高的效率。

由于受到相关国家法律法规的约束, 该实验没有对人工感染鸡的样本进行检测，只对自然感染的具有相关症状的病鸡采肺、气管、脾、血液、子宫及法氏囊组织，应用建立的多重PCR 进行Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的检测，成功地检测到Ndv、Ibv、Iltv和Edsv病原，但没有检测到Aiv与Ibdv的感染，也与采样地没有Aiv和Ibdv疫情出现的实际情况相符合。在比较PCR扩增、测序结果与现场剖检资料时我们发现，数例确诊病鸡仅有精神萎靡、食量下降等病毒感染的早期不典型症状，同时我们还检测出混合感染的病鸡，显示该体系在早期诊断与鉴别诊断具有重要优势。

需要注意的是，鸡场在防控疾病时免疫接种弱毒疫苗，可能会影响对检测结果的准确判定。弱毒疫苗株在体内复制，可能会造成多重PCR检测出现假阳性结果，这也是流行病学调查许多禽畜传染病时的一个难题[15]。所以在使用该技术时，应该考虑疫苗接种史，紧密结合临床发病指征、解剖病变及流行病学进行综合诊断，必要时对扩增产物进行基因测序，以帮助正确判断疫情。在今后的研究中，我们将增加该体系对不同来源毒株的检测，加大对临床样本的直接诊断，使该技术更加程序化和标准化，在养鸡业发挥更大的实用价值。

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(责任编辑：何学华，吴晓红)

Establishment and Application of a Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of six Chicken-related Virus

WU Jing1,2，ZHAO Run-peng1, XU Xue-wei1, WANG Wan1,YANG Xiao-kang1, HU Dong1,2

(1. Department of Immunology and Laboratory Medicine, Medical School,Anhui University of Science and Technology,Huainan,Anhui 232001,China; 2. Institute of Infection and Immunology,Anhui University of Science and Technology,Huainan,Anhui 232001,China)

Avian influenza virus (Aiv) , New castle disease virus (Ndv), Infectious bronchitis virus (Ibv), Infectious laryngo tracheitis virus (Iltv), Infectious bursal disease virus (Ibdv) and Egg drop syndrome virus (Edsv) combine to be the six common chicken-related viruses, which pose great threat to poultry industry. According to the gene sequences of the six common viruses in Nucleotide GenBank, six pairs of specific primers were designed and a multiplex PCR for simultaneous detection of the six viruses was established and optimized. At the same time, some clinical samples were detected. The result shows that this method is performed with a detection limit of 100 fg which had no cross reaction to other pathogens. This study indicates that this method has a good sensitivity and specificity, and it may have an expanded application to the diagnosis of viral diseases in poultry.

multiplex PCR; Aiv; Ndv; Ibv; Iltv

2015-10-13

国家自然科学基金资助项目(81571528；81202294；81302524)；安徽省高校自然科学产学研基金资助项目(KJ2013A105)；安徽省自然科学基金资助项目(1208085QH162)；国家级大学生创新创业训练计划基金资助项目(201210361112；201210361121)；安徽理工大学青年科技拔尖人才基金资助项目。

吴静(1980-)，女，安徽淮南人，副教授，博士，研究方向：肿瘤免疫。

S831.7

A

1672-1098(2016)03-0008-05