直接抗人球蛋白试验阳性在贫血患者的分布特征及临床意义

王晓平　杨君青



·论著·

直接抗人球蛋白试验阳性在贫血患者的分布特征及临床意义

王晓平杨君青

目的分析直接抗人球蛋白试验(DAT)阳性在不同血红蛋白含量贫血患者中的分布特征，并探讨DAT阳性的影响因素及其临床意义。方法采用试管法对不同血红蛋白含量的从轻度至极重度贫血的216例住院患者标本进行直抗试验，阳性者进行分型检测。结果216例患者DAT阳性63例，阳性率29.2%，对DAT阳性患者标本分型，抗-IgG+抗-C3d 阳性42例(占66.7%)；抗-IgG 阳性12例(占19%)；抗-C3d 阳性9例(占14.3%)，阳性率分布以血红蛋白含量在50～59 g/L范围内阳性率最高，达60.9%，与其他贫血组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DAT阳性患者疾病类型分布为自身免疫性溶血性贫血(AIHA)最多为31例(49.2%)，风湿免疫性疾病16例(25.3%)，血液病6例(9.5%)，肿瘤、新生儿溶血病各出现4例(6.3%)，肝脏疾病及其他不明原因DAT阳性各1例(1.6%)。结论DAT阳性是影响患者贫血状态的重要因素之一，对于需接受输血治疗的贫血患者，特别是血红蛋白含量在50～59 g/L范围内的患者在治疗过程中应对其进行DAT检测及分型试验，分析造成其DAT阳性的因素，以保障临床有效输血。

直接抗人球蛋白试验；贫血；输血治疗

贫血(anemia)是指全身循环红细胞总量减少，在临床上表现为外周血单位容积中血红蛋白量(Hb)、红细胞数量(RBC)和血细胞比容(Hct)低于参考区间下限的临床征象，诊断依据常以Hb水平低于参考区间的下限为标准[1]。抗人球蛋白试验 (Coombs试验)是免疫血液学的经典试验，免疫血液学工作使用的抗人球蛋白试验分为间接抗人球蛋白试验(IAT)和直接抗人球蛋白试验(DAT)两种。DAT在临床上主要应用于胎母血型不合新生儿溶血病的诊断、免疫溶血性输血反应的调查、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的诊断、药物诱发型溶血病的诊断等[2]。其他诸多疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、血液病、肿瘤、感染等，均可能出现红细胞存活期缩短、患者的DAT呈阳性[3-5]。文献报道DAT阳性率在贫血待查患者中达60.4%[6]，检测DAT能帮助鉴定溶血是否有免疫基础[7]，以及免疫性溶血性贫血的类型，进而判断溶血的严重程度。为进一步研究不同程度贫血患者中DAT阳性结果的分布范围及概率，探讨造成DAT阳性的因素，我们检测了不同血红蛋白含量贫血患者的DAT，同时对检出的DAT阳性者进行分型检测(抗-IgG+抗-C3d/抗-IgG/抗-C3d)，报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料2015年1～7月在邯郸市第医院住院贫血患者216例。其中男100例，女116例；年龄1 d～78岁，平均年龄52.28岁。临床表现疑似血液病49例、AIHA 37例、风湿免疫性疾病32例、肝脏疾病30例、肿瘤29例、新生儿溶血病17例、感染性疾病16例，其他不明原因6例。患者均有不同程度的肝脾肿大、黄疸等贫血症状。216例患者中，轻度贫血62例(Hb>90 g/L)，中度贫血111例(Hb 60～90 g/L)，重度贫血35例(Hb 30～60 g/L)，极重度贫血8例(Hb<30 g/L)。贫血的一般诊断标准[8]：男性成年人Hb<120 g/L，RBC<4.0×1012/L，Hct<0.40；女性成年人Hb<110 g/L，RBC<3.5×1012/L，Hct<0.35；小儿定为出生后10 d Hb<145 g/L，10 d至3个月 Hb<100 g/L，3个月至6岁Hb<110 g/L，6～14岁Hb<120 g/L；老年人定为Hb<110 g/L，RBC<3.5×1012/L，Hct<0.35。

1.2试剂和仪器直接抗人球蛋白试剂盒(抗-IgG+抗-C3d/抗-IgG/抗-C3d)，上海血液生物医药有限责任公司；日本SYSMEX公司全自动血细胞分析仪及试剂。

1.3检测方法应用全自动血液分析仪检测外周血血红蛋白含量，采集0.5 ml EDTA-K2抗凝的静脉血加入试管中混匀，2 h内进行检测分析，得到相应的血红蛋白结果；DAT采集5 ml患者EDTA-K2抗凝血，离心分离红细胞与血浆，将红细胞用0.9%氯化钠溶液洗涤3次，配成5%的红细胞悬液。分别标记被检、阴性、阳性及自身对照试管4支，向被检管和对照管中分别加入1滴5%红细胞悬液，0.9%氯化钠溶液洗涤3～4次，最后一次洗涤，除尽上清液。立即向被检管中加入抗人球蛋白试剂1 滴，向对照管中加入1滴盐水或6%白蛋白，混匀。1 000 g离心15 s，观察凝集情况，评分并记录结果。若被检管中未观察到凝集，向含有抗球蛋白试剂的试管中加入IgG致敏红细胞，1 000 g离心15 s，观察并记录结果，对阴性结果进行确认，如果IgG 致敏细胞不凝集，阴性结果无效，需重复实验。初检只用多特异性抗球蛋白试剂，如果DAT 阴性，无需后续试验，如果DAT 阳性，再用单特异性试剂(抗-IgG和抗-C3d)做DAT，确定球蛋白种类。多特异性抗人球蛋白试剂阳性标本，再分别用直接抗人球蛋白试剂盒(抗-IgG/抗-C3d)进行分型试验，分型试验按试剂说明书操作。将住院的216例不同程度贫血患者按照血红蛋白含量差异进行分组，分为<50 g/L、50～59 g/L、60～69 g/L、70～79 g/L、80～90 g/L、>90 g/L 6组，统计直抗阳性分布范围及疾病类型。

1.4统计学分析应用SPSS 17.0统计软件,计数资料采用χ2检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1216例贫血患者DAT阳性率216例贫血患者DAT阳性63例，DAT阴性153例，阳性率29.2%。见表1。

表1　216例贫血患者DAT阳性率　例

2.2DAT阳性患者各分型例数及百分率63例DAT阳性患者中，抗-IgG+抗-C3d阳性42例，占66.7%；抗-IgG阳性12例，占19%；抗-C3d阳性9例，占14.3%。见表2。

表2　DAT阳性患者各分型例数及百分率　例(%)

2.3不同血红蛋白含量的患者DAT阳性分布6组患者阳性率比较，血红蛋白含量<90 g/L的5组贫血患者，与>90 g/L组比较差异有统计学意义(P<0.05)；其中50～59 g/L组DAT阳性率最高为60.9%，与其他<90 g/L贫血4组比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中63例DAT阳性患者接受输血次数均为2次及以上，153例DAT阴性患者接受输血次数均<2次。见表3。

2.463例DAT阳性患者疾病类型分布及分型鉴定结果63例DAT阳性患者中，AIHA最多为31例(49.2%)，风湿免疫性疾病16例(25.3%)，血液病6

表3　不同血红蛋白含量的患者DAT阳性分布

例(9.5%)，肿瘤、新生儿溶血病各出现4例(6.3%)，肝脏疾病及其他不明原因DAT阳性各1例(1.6%)。见表4。

表4　63例DAT阳性患者疾病类型分布及分型鉴定结果

3　讨论

Coombs试验，分为直接抗人球蛋白试验(DAT)、间接抗人球蛋白试验(IAT)[9]。如补体成分依次从C5～C9激活，则引起红细胞溶血，如补体成分只是从C1～C3激活，激活的C3结合红细胞膜上C3受体，C3可进一步激活为C3d等，红细胞膜上形成稳定的补体C3d-C3d受体复合物。此时红细胞标本加人抗补体抗体，可出现凝集反应[10]。临床上诸多疾病患者均可表现出不同程度的黄疸、肝脾肿大等贫血症状，且部分疾病可引起DAT阳性[11,12]，而DAT阳性表明患者红细胞表面致敏了不完全抗体和(或)补体，DAT阳性患者可出现新生成红细胞又被致敏破坏，或患者红细胞被破坏的速度快于机体造血而造成不同程度贫血[13]。这说明抗人球蛋白试验在相关疾病诊断及进行输血治疗方面具有一定的临床价值[5,12]。

本研究检测的住院贫血患者DAT阳性率为29.2%，高于张小伟等[5]报道的河北承德地区患者DAT阳性率(14.0%)，考虑可能因素为张小伟等[5]的研究样本包括了门诊及住院患者，而本研究只选择了住院的贫血患者，故DAT阳性率较高。探讨DAT阳性的疾病类型分布，可间接分析造成贫血的原因，本研究DAT阳性患者中，疾病类型分布为AIHA最多为31例(49.2%)，风湿免疫性疾病16例(25.3%)，血液病6例(9.5%)，肿瘤、新生儿溶血病各出现4例(6.3%)，肝脏疾病及其他不明原因DAT阳性各1例(1.6%)。多种疾病诸如SLE、血液病、肿瘤等其DAT阳性结果可持续48 h～3个月，而AIHA导致的阳性结果则会长期存在[5]。AIHA既可作为原发性疾病单独存在，也可继发于其他疾病，血中有自身抗体和(或)针对自身抗原的致敏淋巴细胞，自身抗体在不同自身免疫病中有交叉或重叠现象；病程慢性迁延，发作和缓解反复交替，有的成为终身痼疾；组织损害部位有淋巴细胞和浆细胞浸润，常见嗜酸性粒细胞增多；免疫抑制剂(包括肾上腺皮质激素)或手术切除淋巴组织有一定疗效[10]。其他继发AIHA的疾病如血液系统、风湿类疾病等导致的DAT阳性，其原因主要是红细胞自身抗体或者免疫复合物黏附在红细胞膜上，并由于致病因素引起自身抗原的变异及免疫稳定性的破坏，致使免疫调节功能紊乱而产生[14]。本研究发现不同的DAT 阳性患者中AIHA 和风湿免疫性疾病明显高于其他病种，与文献报道[14]一致。

DAT的作用在于评估获得性溶血性贫血病因，不能用来测定溶血存在与否，甚至少数AIHA患者的DAT是阴性的，另据报道DAT阳性反应发生率也占无溶血性贫血住院患者的8%[10]。DAT阳性患者与其红细胞附着抗体的种类、补体也有关联，文献报道AIHA患者中单独IgG型主要为继发性因素，病因包括感染、药物诱发、自身免疫性疾病等[15]，报道显示单独IgG型在温抗体型AIHA中占20%[10]；单独C3d阳性主要为冷凝集素综合征，是伴有冷反应性自身抗体的身免疫性溶血性贫血中最常见的一种类型，占免疫性溶血性贫血的16%～32%[10]， 其发病分为急性及慢性，急性常继发于淋巴组织增生症(如淋巴瘤)或肺炎支原体感染，慢性的常发生在老年人有轻度到中等程度溶血，冷凝集素综合征为细胞首先被C3的C3d补体致敏，患者是否溶血取决于其免疫状态[16]；抗-IgG和抗-C3d同时阳性以混合型AIHA为主，混合型AIHA在急性情况常常伴有十分低的血红蛋白浓度特性出现，可为原发的或继发，常常与系统性红斑狼疮有关，特别需注意的是系统性红斑狼疮患者在其红细胞上有补体致敏，甚至不存在明显溶血，但当系统性红斑狼疮患者继发成为AIHA，则表明患者红细胞上已经致敏了补体和IgG[10]，混合型AIHA其产生自身抗体和补体，作用于红细胞膜上，导致红细胞破坏增多而引起的溶血性贫血，由于输入的红细胞将很快被破坏清除，其改善机体缺氧的效果是短暂的，通常不主张输血[17]，仅在需要时给予，以维持足够的输氧作用。

如急慢性贫血患者需要输注红细胞，一般需通过增加患者的Hb浓度来提高其血液携氧能力[18]。Hb水平低于参考区间下限可作为贫血的诊断标准，不同的Hb含量则部分体现了贫血患者处在不同的病程。本研究发现，血红蛋白含量在50～59 g/L范围内的贫血患者接受输血治疗其血红蛋白不见增加或是提高不明显的可能性更大。且63例DAT阳性患者接受输血次数均为2次及以上，超过DAT阴性患者，说明DAT阳性对临床输血治疗效果有一定影响，所以应更加注重去除造成DAT阳性的因素，以保障临床对内科贫血患者的有效输血。

综上所述，DAT阳性是影响患者贫血状态的重要因素之一，对于需接受输血治疗的住院贫血患者，特别是血红蛋白含量在一定范围内的患者在治疗过程中更应重视对其进行DAT检测及分型试验，分析造成其DAT阳性的因素，以保障临床有效输血。由于本研究纳入的患者样本数量及统计分析的DAT阳性例数不多，故试验结果可能出现系统误差，需将来进一步扩大样本量并对更多DAT阳性样本进行研究。

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056002河北省邯郸市第一医院输血科(王晓平)；河北省秦皇岛市中心血站(杨君青)

杨君青，066000河北省秦皇岛市中心血站；

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2015-12-12)