壳聚糖固定化果胶酶澄清低度姜酒的工艺优化

秦珂，孙静（.山东省莱芜市第一中学，山东莱芜2700；2.莱芜职业技术学院生物教研室，山东莱芜2700）

壳聚糖固定化果胶酶澄清低度姜酒的工艺优化

秦珂1，孙静2，*
（1.山东省莱芜市第一中学，山东莱芜271100；2.莱芜职业技术学院生物教研室，山东莱芜271100）

采用壳聚糖固定化果胶酶澄清低度姜酒。在单因素试验的基础上，采用正交试验确定固定化果胶酶澄清低度姜酒的最优工艺为：固定化酶浓度为60 g/L，pH值为3.5，酶解温度和时间分别是45℃和12 h。在该工艺下低度姜酒透光率可达98.9%，所得低度姜酒稳定性好，壳聚糖固定化果胶酶重复使用7次后姜酒透光率仍保留有81.2%。固定化果胶酶比游离酶澄清低度姜酒效果好，稳定性提高。

壳聚糖；固定化酶；果胶酶；低度姜酒；澄清

果胶酶作为一种有效的澄清剂，利用果胶酶水解引起混浊的果胶物质广泛用于果汁、果酒的澄清［1-2］，研究人员之前已进行了果胶酶澄清低度姜酒的研究［3］，但由于游离的果胶酶稳定性较差，易失活，价格高，不易回收利用，而固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应物分开等显著优点成为当今研究热点［4-7］。本文以戊二醛为交联剂，壳聚糖为载体制备固定化果胶酶，应用于低度姜酒的澄清工艺中，确定最佳工艺参数，以期为低度姜酒的澄清工艺提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

壳聚糖（食品级）：上海卡博工贸有限公司生产；果胶酶（食品级，粉末状）：郑州众信化工产品有限公司；TGL18台式离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；79-1型磁力加热搅拌器：金坛市华伟仪器厂；UV-2102PC紫光可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；FA1004电子分析天平：上海市百典仪器厂；抽滤装置等。

1.2方法

1.2.1工艺流程［3］

生姜→姜酒→酶解→过滤→灌装→检验→成品

1.2.2壳聚糖固定化果胶酶的制备

100 mL 1%冰醋酸中加壳聚糖1 g，搅拌均匀，滴入10%NaOH溶液至pH 7.0，加入5%戊二醛，搅拌静置抽滤并用去离子水洗至中性后加入果胶酶液（果胶酶/壳聚糖=10 mg/1 g），缓慢振荡混合30 min左右，4℃条件下固定12 h，用蒸馏水冲洗、抽干制得固定化果胶酶［8］。

1.3测定方法［3］

低度姜酒澄清度、色度的测定：采用分光光度计法，分别以透光率值T670、A420表示。

可溶性固形物：糖度计法。

总糖：直接滴定法，以葡萄糖计（GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》）。

总酸：滴定法。

总酚：Folin—Denis法。

稳定性研究：通过将酒液冷冻到接近其冰点，观察有无沉淀现象及瓶底沉淀物的多少。

1.4固定化果胶酶澄清低度姜酒的工艺参数确定

1.4.1单因素试验

研究固定化酶用量（浓度）、pH值、酶解时间、反应温度4个因素对固定化酶澄清低度姜酒的影响。

1.4.2正交试验

以透光率作为质量指标，根据单因素试验结果，以果胶酶浓度、pH值、酶解时间、温度进行四因素三水平正交试验，确定最优固定化果胶酶澄清条件。

1.5最优条件澄清低度姜酒的效果评价

在最优条件下进行3组平行试验，对固定化果胶酶处理前后低度姜酒的透光率T670、吸光度A420、可溶性固形物、总酸、总酚、稳定性进行评价。

1.6壳聚糖固定化果胶酶的操作稳定性

在最优条件下，连续使用固定化果胶酶澄清低度姜酒10次，测定低度姜酒的澄清度，试验平行3次，每次使用后用去离子水清洗壳聚糖固定化酶，抽干。

2　结果与分析

2.1固定化果胶酶澄清低度姜酒单因素试验结果

2.1.1固定化果胶酶浓度的影响

分别在一定量的低度姜酒中加入30、40、50、60、70 g/L固定化果胶酶，调pH值为4，45℃下酶解12 h，取上清液测透光率。试验平行3次，结果显示透光率随固定化果胶酶浓度增加而升高，当加酶量增加至60 g/L以上时，透光率的增幅较小。故选用50 g/L～70 g/L范围用于正交试验。

2.1.2固定化果胶酶酶解温度的影响

在一定量的低度姜酒中加入固定化果胶酶60 g/L，调节pH值为4，温度分别为30、40、45、50、55℃，酶解12 h，取上清液测透光率。试验平行3次，结果显示随温度升高，低度姜酒透光率先增加后下降；45℃时，透光率达到最大，故选用40℃～50℃范围用于正交试验。

2.1.3固定化果胶酶酶解时间的影响

在一定量的低度姜酒中加入固定化果胶酶60 g/L，调节pH值为4，温度45℃，分别酶解3、6、9、12、15 h，取上清液测透光率。试验平行3次，结果显示，透光率随酶解时间的延长而升高；12h时，透光率达到最大，当酶解时间达到12 h以上时，透光率的增加较缓慢，说明酶解反应已基本完成，故选用9 h～15 h范围用于正交试验。

2.1.4固定化果胶酶酶解pH值的影响

在一定量的低度姜酒中加入固定化果胶酶60 g/ L，45℃酶解12 h，调pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，取上清液测透光率。试验平行3次，结果显示低度姜酒透光率在pH值为3.5之前，呈急速上升趋势，在pH值为3.5时达到最大值，超过3.5后，又呈下降趋势。说明pH 3.5为固定化果胶酶的最适pH值，故选用pH值为3.0～4.0范围用于正交试验。

2.2酶解的正交试验结果

在单因素试验基础上，对酶用量（A）、作用温度（B）、酶解时间（C）、pH值（D）进行综合研究，选用L9（34）正交表进行试验，以透光率作为质量指标，结果见表1。

表1　固定化果胶酶澄清低度姜酒正交试验结果Table 1　Results of orthogonal test L9（34）for clarifying low-ginger liquor of the immobilized pectinase

由表1极差分析可知，影响低度姜酒透光率的因素顺序是作用温度（B）＞pH值（D）＞固定化果胶酶用量（A）＞酶解时间（C）。固定化果胶酶澄清低度姜酒的最佳水平为：A2B2C2D2，即最佳酶解工艺条件为：酶量为60 g/L，温度为45℃，pH值为3.5，酶解时间为12 h。

2.3最优条件下固定化果胶酶澄清低度姜酒效果评价

为探讨最优条件澄清低度姜酒的效果，以固定化果胶酶用量为60 g/L，处理温度为45℃，处理pH值为3.5，酶解时间为12 h进行试验，以透光率、色度、可溶性固形物、总酸、总酚、稳定性等为指标，测定澄清前后低度姜酒各项指标变化结果见表2。

由表2可知，固定化果胶酶处理低度姜酒后，透光率为98.9%，提高22.86%，吸光度、总酚含量、可溶性固形物、总糖、总酸含量分别降低79.65%、54.37%、16.95%、20.31%、16.89%，稳定性增加。固定化果胶酶的澄清效果要比单独使用游离酶要好［3］。这可能是因为壳聚糖是天然的阳离子型絮凝剂，对蛋白质、多酚、果胶等具有良好的吸附和絮凝作用，壳聚糖和果胶酶二者结合，有利于提高澄清效果、降低成本［9-10］。

表2　最优澄清处理对低度姜酒相关指标的影响Table 2　Effects of clarifying treatments on related indicators of low-ginger liquor

2.4壳聚糖固定化果胶酶的操作稳定性

为了研究固定化酶的稳定性，对固定化果胶酶连续进行10批次澄清姜酒的操作，结果见表3。

表3　壳聚糖固定化果胶酶澄清低度姜酒的操作稳定性Table 3　Stability of immobilized pectinase on clarification of low-ginger liquor

由表3可知，随着固定化果胶酶澄清姜酒重复次数的增加，姜酒透光率逐渐下降，可能是因为壳聚糖固定化果胶酶本身失活以及回收过程中损失引起的［5-6］。连续使用7次后，姜酒透光率仍能达到81.2%，说明该固定化酶具有一定的操作稳定性。相比单纯使用游离果胶酶，壳聚糖固定化酶可反复或连续使用，降低成本，提高酶的稳定性。

3　讨论与结论

壳聚糖是氨基葡萄糖的直链多聚糖，对人体无毒、无害［8］，采用壳聚糖作为载体制得的固定化酶，机械强度大，稳定性好，重复利用率高，降低了生产成本、提高了产品质量［11］。

固定化果胶酶酶解低度姜酒，相对单独使用游离酶，澄清效果好，研究表明，最佳工艺条件为：酶量为60 g/L，温度为45℃，pH值为3.5，酶解时间为12 h。在此条件下所得姜酒透光率为98.9%，所得姜酒清彻透明，黄色至金黄色，久置无分层，无悬浮物，稳定性好，提高了低度姜酒的质量。

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Optimization the Technology of Low-ginger Liquor Clarification by the Pectinase Immobilized with Chitosan

QIN Ke1，SUN Jing2，*
（1.Laiwu No.1 Senior High School Shandong Province，Laiwu 271100，Shandong，China；2.Biochemistry Staff
Room，Laiwu Vocational Technology Institute，Laiwu 271100，Shandong，China）

Chitosan-immobilized pectinase was applied to clarify low-ginger liquor.Based on the result of single factor experiments，orthogonal experiment was performed.The optimizate conditions for charification of lowginger liquor were：immobilized enzyme amount 60 g/L，pH value 3.5，enzymolysis temperature 45℃，enzymolysis time 12 h，transmittance reached 98.9%，The transmittancy of low-ginger liquor was 81.2%after immobilized enzyme was repeatedly used seven times.The clarification effects of immobilized enzyme were better than free enzyme.

chitosan；immobilized enzyme；pectinase；low-ginger liquor；clarification

2015-09-19

山东省科技发展计划项目（2011GGA12054）；莱芜高新区科技创新与发展计划项目（201015）

秦珂（1998—），女（汉），高中，研究方向：生物、化学实验研究。

孙静，女（汉），副教授，研究方向：生物化工及生物化学教学及研究。