白藜芦醇分子印迹聚合物的应用及性能研究

冯涛，刘鹏，刘海燕，锁然（.河北农业大学理学院，河北保定07000；.河北大学工商学院实验管理中心，河北保定07000；.河北农业大学食品科技学院，河北保定07000）

白藜芦醇分子印迹聚合物的应用及性能研究

冯涛1，刘鹏2，刘海燕1，锁然3
（1.河北农业大学理学院，河北保定071000；2.河北大学工商学院实验管理中心，河北保定071000；3.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

采用分子印迹技术以白黎芦醇为模板分子，选择丙烯酰胺作为白藜芦醇印迹聚合物的功能单体，氯仿和四氢呋喃的混合溶液作为印迹聚合物合成溶剂，制备了白黎芦醇分子印迹聚合物，考察了分子印迹聚合物的吸附性能、选择性能以及固相萃取性能。优化分子印迹固相萃取的萃取条件，选择30%（体积分数）的乙醇-水溶液5 mL作为上样溶液，选择40%（体积分数）的乙醇-水溶液作为淋洗液、80%（体积分数）的乙醇-水溶液作为洗脱液。

虎杖；白藜芦醇；高效液相色谱；提取纯化；分子印迹

白藜芦醇具有多种生物活性，主要包括抗肿瘤、心血管保护、防治骨质疏松、抗氧化和清除自由基等［1-2］。白藜芦醇在常见的药用植物中广泛存在，如虎杖、决明、藜芦等。但是由于其在天然植物中的含量较低，分离纯化得到高含量成品的成本较高，大大限制了其在医药、保健食品等领域中的推广应用。国内外生产和销售白藜芦醇的企业，均以天然植物（葡萄或中药虎杖）为原料来提取分离白藜芦醇。目前，白藜芦醇的分离纯化主要采用有机溶剂提取、硅胶柱层析或大孔吸附树脂吸附等方法。但是，这些分离纯化方法有机溶剂消耗量大，环境污染严重，操作相对繁琐，产率低，产物杂质较多；高速逆流色谱、超临界流体色谱技术在分离纯化白藜芦醇方面得到了较好效果，产品纯度高，但其生产设备昂贵，提取成本相对较高［3-7］。因此，探索新的分离纯化技术，提高分离纯化效率尤为重要。本文拟采用分子识别性能好的分子印迹聚合物进一步纯化白藜芦醇粗提物，达到简化提取物纯化过程、提高白藜芦醇分离纯化效率的目的。

1　材料与方法

1.1主要试验仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（配DAD检测器）：美国Agilent；色谱柱，Diamonsil C18柱（250 mm× 4.6 mm×5 μm）：北京华瑞博远科技有限公司；FD5-2.5真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；DF-101S 78-1磁力恒温加热搅拌器：国华电器有限公司；BS 224 S电子分析天平：美国sartorius公司；KUDOS SK5200H超声波清洗器：天津市瑞普电子仪器公司。

1.2主要试验试剂及材料

虎杖：河北安国药材市场；白藜芦醇（Res）纯品（≥98%）：天津市尖峰天然产物研究开发有限公司；丙烯酰胺（AM），分析纯：天津医药公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）：德国FLUKA公司；偶氮二异丁腈（AIBN），分析纯：天津市福晨化学试剂厂；95%乙醇，分析纯：天津市化学试剂厂；乙腈，色谱纯：上海市化学试剂厂；纯净水：乐百氏。

1.3方法

1.3.1白藜芦醇的高效液相色谱检测方法

色谱柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（40-60，体积比）；流动相流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；检测波长：306 nm。

1.3.2白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法［8-13］

聚合物的合成采用溶液聚合方法，以反式白藜芦醇为模板分子、丙烯酰胺（AM）为功能单体、偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂进行自由基引发聚合。

称取0.45 g（2 mmol）白藜芦醇和0.71 g（10 mmol）功能单体丙烯酰胺充分溶解于（10 mL氯仿+5 mL四氢呋喃）混合溶液中，置于封闭管中超声10 min后，放置3 h，使模板分子与功能单体充分发生作用，再加入8 g（40 mmoL）交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）和100 mg引发剂偶氮二异丁腈，充分混溶后，通氮气脱氧10 min，在真空状态下密封，然后于50℃恒温水浴中聚合24 h，所得的棒状聚合物用研钵磨碎并过200目孔筛，取粒径小于75 μm的颗粒，用5%（体积分数）乙酸的甲醇溶液置索氏提取器中提取24 h，除去模板分子及未反应化合物，然后用乙腈洗涤除去残留的乙酸和甲醇，聚合物颗粒经丙酮反复沉降，除去细颗粒后真空干燥，即为白藜芦醇分子印迹聚合物（MIP）。空白聚合物的制备方法同上，但未加模板分子，得到非印迹聚合物（NMIP）。

2　结果与讨论

2.1白藜芦醇标准曲线的绘制

准确称取白藜芦醇对照品0.0250 g置于25 mL容量瓶中，用40%甲醇溶解定容，配成1 mg/mL标准储备液备用，低温、避光保存。分别准确取储备液0.025、0.25、 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，用40%（体积分数）甲醇定容至25 mL，摇匀。分别相当于质量浓度为1.0、10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、240.0、280.0 μg/mL的标准溶液。用0.45 μm滤膜过滤，分别取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以色谱峰面积A为纵坐标、白藜芦醇质量浓度C为横坐标绘制标准曲线，见图1。

图1 白藜芦醇的标准曲线Fig.1　Standard curve of resveratrol

由图1可以看出，白藜芦醇在质量浓度1.0 μg/mL～280.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，标准曲线的线性回归方程A=52.33C＋106.21，线性相关系数r=0.999 3。

2.2白藜芦醇分子印迹聚合物的制备

2.2.1白藜芦醇分子印迹聚合物功能单体及溶剂的选择

白藜芦醇含有多个酚羟基，具有一定的极性，不溶于氯仿等非极性溶剂，一般认为在非共价分子印迹技术中，溶于极性溶剂的化合物不适宜作为模板分子。因此，合成白藜芦醇印迹聚合物的功能单体必须能在极性溶剂中与白藜芦醇形成氢键。甲基丙烯酸是分子印迹聚合物常用的功能单体。由于在极性溶剂中酰胺比羧酸能形成更强的氢键，因此，选择丙烯酰胺作为白藜芦醇印迹聚合物的功能单体，氯仿和四氢呋喃的混合溶液作为印迹聚合物合成溶剂。

2.2.2白藜芦醇在分子印迹聚合物上的结合等温线及结合特性

采用静态平衡法测定印迹聚合物对不同浓度白藜芦醇（Res）的结合等温线。精确称取10份相同的白藜芦醇印迹聚合物粉末，分别置于10个10 mL离心管中，分别加入5 mL不同浓度（0.2 mmol/L～4.0 mmol/L）的白藜芦醇-乙醇溶液，在25℃下恒温振荡8 h后，在1 000 r/min转速下离心，取上清液用高效液相色谱法在306 nm波长处测定平衡溶液中的白藜芦醇的含量，即吸附平衡浓度（Ce）。模板分子在印迹聚合物上的平衡吸附量（Q，mmol/g）可通过下式计算：

式中：C0和Ce分别为模板分子的起始浓度和平衡浓度，mmol/L；V为溶液的体积，mL；W为印迹聚合物的质量，g。

同时，按上述方法做空白聚合物（NMIP）的静态吸附试验。

通过静态吸附试验，研究了白藜芦醇在印迹聚合物和非印迹聚合物上的吸附行为。MIP和NMIP对白藜芦醇的结合等温线见图2。

图2MIP和NMIP对白藜芦醇的结合等温线Fig.2　Binding isotherms of resveratrol on MIP and NMIP

由图2可以看出，印迹聚合物对白藜芦醇具有一定的吸附能力，而非印迹聚合物对白藜芦醇吸附很小，表明印迹聚合物对白藜芦醇确实具有印迹能力。白藜芦醇可通过氢键和空间匹配达到吸附，而对于NMIP，虽然白藜芦醇也能与聚合物上的酰胺健形成氢键，但由于位置关系，不具有作用位点的匹配性，每个白藜芦醇分子往往只能与吸附剂形成一个氢键，这样作用力远小于MIP对白藜芦醇的作用力，因此NMIP对白藜芦醇吸附力很弱。

式中：Q和Qmax为平衡结合量，μmol/g和最大表观结合量，μmol/g；Ce为溶液中平衡浓度，mol/L；KD为结合位点的平衡离解常数，mol/L。当以Q/Ce对Q作图时，根据线性关系的斜率和截距可求得KD和Qmax两个参数。

白藜芦醇在MIP上的Scatchard分析见图3。

图3　MIP的Scatchard曲线Fig.3　The scatchard curve of MIP

由图3可以看出，Scatchard曲线呈非线性相关性，说明白藜芦醇在MIP上的结合位点的能量不均。将图中散点分成两部分，分别进行线性回归，得到条不同斜率的直线，说明在所研究的模板分子浓度围内，MIP主要存在着两种不同能量的结合位点。根直线的斜率和截距，分别计算出两种结合位点的离常数KD和最大表观结合量Qmax。

对于高能结合位点，KD1和 Qmax1分别为 1.58× 0-4mol/L和36.61 μmol/g；对于低能结合位点，KD2和max2分别为2.38×10-3mol/L和125.37 μmol/g。MIP中产生有两种不同结合能量的位点，这说明模板分子白藜芦醇与功能单体预组织时可能存在着两种组织方式，因而在MIP中就留下两种结合位点。

2.2.3白藜芦醇分子印迹固相萃取柱的制备及分离纯化条件优化

称取200 mg白藜芦醇分子印迹聚合物粉末（过200目筛），均匀装填进500 mg/3 mL的聚丙烯固相萃取空柱中，柱的上、下端均以聚乙烯微孔筛板固定。固相萃取过程中每次活化、上样、淋洗及洗脱溶液的体积均为5 mL。固相萃取柱在每次使用前，依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。萃取柱的流速控制在1 mL/min左右，萃取过程中的溶液由高效液相色谱仪分析。

固相萃取的优点之一是萃取柱的负载量大，但使用不同溶剂时萃取柱的负载量也会随之变化。因为白藜芦醇易溶于乙醇，而且其他有机溶剂一般有不同程度的毒性，不宜应用在食品、医药领域，故选择不同体积比的乙醇-水溶液作为上样溶剂，分别检测流出液中白藜芦醇的含量，考察印迹和非印迹萃取柱对白藜芦醇的吸附情况。

上样溶液中乙醇的体积分数对白藜芦醇吸附的影响见图4。

图4　上样溶液中乙醇的体积分数对白藜芦醇吸附的影响Fig.4　Effects of the volume fraction of ethanol on resveratrol adsorption in the sample solution

由图4可知，当上样溶液中乙醇的体积分数小于40%时，印迹萃取柱均可吸附大部分白藜芦醇，而非印迹萃取柱在乙醇体积分数小于20%时才能吸附大部分白藜芦醇；随着上样溶液中乙醇体积分数的逐渐增加，印迹和非印迹萃取柱的负载量均开始下降，但其在印迹聚合物上的吸附量要比在非印迹聚合物上的吸附量大。考虑到吸附量，选择含体积分数为30%的乙醇-水溶液5 mL作为上样溶液，该试验条件可确保大部分白藜芦醇能被吸附。

淋洗液、洗脱液的选择也非常重要。淋洗溶剂的强度必须达到能够洗掉尽量多的不需要组分，但不能强到洗脱目标物的程度。根据上样溶液中乙醇的体积分数对白藜芦醇吸附的影响曲线，选择40%（体积分数）的乙醇-水溶液作为淋洗液、80%（体积分数）的乙醇-水溶液作为洗脱液。

按上述选择的条件进行固相萃取操作，每隔0.5mL分别收集一次洗脱液，检测各洗脱液中的白藜芦醇含量，计算回收率，考察白藜芦醇的洗脱分布情况，以确定适宜的洗脱液收集体积。

白藜芦醇的洗脱曲线见图5。

图5　白藜芦醇的洗脱曲线Fig.5　The elution curve of resveratrol

由图5可以看出，白藜芦醇集中在第1.5mL～4.5mL体积内，因此，收集液的体积可控制在3 mL，在一定程度上起到了浓缩样品的作用。

2.2.4虎杖提取物的分离纯化

称取2.0 g虎杖粗粉，加入60%（体积分数）乙醇20 mL，在35℃下超声提取20 min，以水定容至50 mL，混匀、静置，过滤。按上述分子印记固相萃取方法操作，收集洗脱液，用氮气吹干后以甲醇溶解定容，用高效液相色谱仪检测白藜芦醇，并与固相萃取前的提取液对比。

虎杖提取液的色谱图见图6，洗脱液的色谱图见图7。

由图6可以看出，虎杖提取液所含成分较多，而经过分子印记固相萃取后，洗脱液中主要成分为白藜芦醇，只含有少量的杂质（图7）。比较上样前与洗脱后的溶液中白藜芦醇的总量，计算出白藜芦醇的收率为73.6%，洗脱液中白藜芦醇的纯度为89.2%。

图6 虎杖提取液的色谱图Fig.6　The chromatotogram of Polygonum cuspidatum extract

图7 洗脱液的色谱图Fig.7　The chromatotogram of the eluent

3　结论与展望

结果表明，分子印迹聚合物的Scatchard模型的功能单体与模板分子白藜芦醇与预组织时可能存在着两种组织方式。这使得分子印迹聚合物对模板分子具有高度的选择性和专一的识别性，采用固相萃取法将该分子印迹聚合物直接用于复杂体系（虎杖提取液）中白黎芦醇的分离纯化，样品仅经一步处理，即可除去大部分杂质，达到良好的分离效果，展示了该技术的应用前景。

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Application and Performance Study of Molecular Imprinted Polymer of Resveratrol

FENG Tao1，LIU Peng2，LIU Hai-yan1，SUO Ran3
（1.College of Science，Agricultural Univercity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.Experimental Management Center，Business School，Hebei Univercity，Baoding 071000，Hebei，China；3.College of Food
Science and Technology，Agricultural Univercity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Molecular imprinting technolog was adopted to prepare resveratrol molecularly imprinted polymer，with resveratrolas template molecule，with acrylamide as functional monomer of resveratrol molecularly imprinted polymer.Mixed solution of chloroform and tetrahydrofuran were selected as solvent to synthesis molecularly imprinted polymer.The performance of the molecularly imprinted polymer，such as adsorption，selection and solid phase extraction were studied.By optimized the extraction condition of molecularly imprinted solid phase extraction，it was determined that ethanol aqueous solution（30%）5 mL was the in-flux solution，ethanol aqueous solution（40%）was spraying，ethanol aqueous solution（80%）was eluent.

polygonum cuspidatum；resveratrol；HPLC；extraction and purification；molecular imprinting

2015-08-18

科技支撑计划项目（16ZF028）

冯涛（1980—），女（汉），实验师，研究生，研究方向：分析化学。