茯茶“散茶发花”加工前后差异化学成分的分离与鉴定

黄浩，赵熙，黄怀生，银霞，粟本文，钟兴刚，黄建安，郑红发*，刘仲华*



茯茶“散茶发花”加工前后差异化学成分的分离与鉴定

黄浩1,2,3，赵熙1，黄怀生1，银霞1，粟本文1，钟兴刚1，黄建安2,3，郑红发1*，刘仲华2,3*

1. 湖南省茶叶研究所，湖南 长沙 410125；2. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；3. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128

以乌龙茶（大红袍）、红茶、绿茶、黑茶（天尖茶原料、金湘益茯砖茶原料）为加工原料，运用“散茶发花”技术，加工制得不同茶类散装茯茶制品。本研究以不同性质茶叶的“发花”（真菌固体发酵）前后茶样作为研究对象，将“发花”前后的茶样经HPLC图谱叠加比对分析，寻找“发花”前后主要新增差异化学成分，同时运用制备色谱制备目标差异化学成分，并经HR-MS和NMR技术对其进行结构鉴定。结果表明，在本研究的分离条件下，不同性质的5种茶叶原料经相同“发花”处理后，各组形成的差异化学成分基本表现一致，其中选取分离、鉴定的两种新增差异化学成分均为黄酮醇化合物，分别是槲皮素和山奈酚。

茯茶；散茶发花；新增差异化学成分；黄酮类化合物；槲皮素；山奈酚

历年来，我国西北地区游牧名族日常生活以牛、羊肉及奶制品等高脂、高热量食物为主，蔬菜缺乏的边疆地区将传统茯砖茶作为膳食纤维添加而被人们广泛摄取，气候特点与饮食习惯造就了茯砖茶在边疆地区的兴起，该茶成了人们日常生活的必需品，“宁可三日无粮，不可一日无茶”[1]的美誉在边疆地区的流传见证了茯砖茶在我国边疆地区的兴旺与发展。生活水平的提升与健康理念的加强，现代化茯茶加工工艺的发展及创新型茯茶产品的涌现推动了茯茶产业链的形成和高速发展，显著提升了茯茶制品的流通量，如今，茯茶制品的销售区域也由过去的边疆地区逐渐向内陆地区甚至全世界迅速扩张。

茯茶不仅因其独特的加工工艺与风味品质闻名于世，且其突出的保健功效也逐渐成为人们关注的焦点。独有的“发花”工艺与成品茶中形成的优势“金花”菌使现代化茯茶具备了区别于其加工原料的特有品质风味与保健功效[2]，现代科学研究证明，茯茶在调节高血脂症、高血糖症、减肥等保健功效方面有着突出的功效[3-5]，“金花”菌则被视作为保健功效的关键，因此，“发花”处理的茯茶成品中特异性功能成分的分离与鉴定成了研究的重点。本研究运用现代化茯茶加工新技术——茯茶“散茶发花”技术，分别以不同茶类原料茯茶的“发花”（真菌固体发酵）前后茶样作为研究对象，对“发花”前后的茶样经HPLC图谱叠加比对分析，寻找“发花”前后主要新增差异化合物，并运用制备色谱制备目标差异化合物，经HR-MS和NMR技术对其进行初步鉴定，以期为茯茶保健功效的机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

“金花”菌——冠突散囊菌（）[6]，为湖南农业大学茶学教育部重点实验室藏菌株，分离自湖南益阳茶厂有限公司产茯砖（800 g装，产于2007年）。

1.2 供试茶叶及取样

2013年产大红袍（福建武夷山，代号A），2010年产红茶（湖南石门，代号B），2011年产绿茶（湖南石门，代号C），2012年产天尖茶原料（湖南安化，代号D），2008年金湘益茯砖茶原料（湖南益阳，代号E）。按照“散茶发花”的技术要求[2]对以上4种不同茶类的5种茶叶原料进行“散茶发花”处理（n=6），恒温恒湿培养箱中发花10 d，“发花”后茶样经70℃干燥4 h，编号并置于－20℃冰箱中储存备用。

1.3 试剂

儿茶素、生物碱、槲皮素、山奈酚等标准品（纯度≥95%）均购置Sigma公司，乙腈（色谱纯，美国MERCK公司），甲醇（色谱纯，美国Honeywell公司），乙酸（分析纯，成都科龙化学试剂有限公司），超纯水（Millipore超纯水仪自制）。

1.4 仪器与设备

Delta320 pH计（Mettler）、Motic B1光学显微镜（Motic公司）、万分之一电子天平（Mettler AE240）、MIKRO-35高速冷冻离心机（德国Hettich）、苏净双人单面超净工作台（苏净集团安泰公司生产）、振荡恒温培养箱（上海苏坤实业有限公司）、恒温培养箱（江苏环保仪器厂）、高温高压灭菌锅（上海医用核子仪器厂）、恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备公司）、冷冻干燥仪（广州贝立思有限公司）、旋转蒸发仪（瑞士Buchi）、Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent 6320离子阱质谱、Bruker 400 Ultra-ShieldTM超导脉冲傅立叶变换核磁共振、水浴锅、5 mL一次性注射器（河南曙光健士医疗器械集团有限公司）、100 mL容量瓶、0.45 µm微滤过滤头（Millipore）等。

1.5 “散茶发花”茯茶茶样与茶汤制备

按照“散茶发花”的技术要求将各茶类原料加水至相同最终含水量，接以相同剂量的冠突散囊菌，置培养箱中控温、控湿培养10 d，“发花”结束后置于70℃恒温干燥箱中4 h即可取出封存[7]。

准确称取干燥茶样2.0 g至锥形瓶，加沸水100 mL置90℃水浴锅中浸提30 min，期间每10 min摇瓶1次，浸提结束后精细抽滤于100 mL容量瓶中冷却定容，混匀备用[8-9]。分析检测与鉴定样品需经孔径0.45 µm滤膜过滤。

1.6 “散茶发花”茯茶加工前后差异化合物分析

1.6.1 “散茶发花”茯茶发酵前后HPLC图谱 分析

色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD紫外检测器、自动进样器及柱温箱，色谱柱Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相A为0.2%乙酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为1 mL·min-1，柱后分流0.5 mL·min-1进入质谱离子源，柱温30℃，进样量5 µL，检测波长280 nm，梯度条件[10]为：0~4 min，B：6%；4~16 min，B：6%~14%；16~22 min，B：14%~15%；22~32 min，B：15%~18%；32~ 37 min，B：18%~29%；37~47 min，B：29%~ 45%；47~52 min，B：45%；52~53 min，B：45%~6%；53~63 min，B：6%。

质谱条件：正、负离子ESI源的Agilent 6320离子阱质谱，雾化器压力为45 psi，毛细管电压：3.5 kV，干燥气流速为12 mL·min-1，干燥气温度为350℃，质量扫描范围：100~1000 amu。

1.6.2 “散茶发花”茯茶目标差异物制备与鉴定

（1）茶叶水提物制备：将茶叶粉碎后参照1.5提取，精细抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后至冷冻干燥器中冻干，获得茶叶提取物干粉，袋装封口置于－20℃冰箱中备用。

（2）色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱LUNA C18（50 mm×250 mm，10 µm），DAC：Novasep 50 mm，流动相：乙腈（0.1%三氟乙酸）∶硝酸铈铵=70∶30，流速为118 mL·min-1，进样量5 mL，运行时间为30 min。

（3）质谱测定条件：正、负离子ESI源的Agilent 6320离子阱质谱，雾化器压力为45 psi，毛细管电压：3.5 kV，干燥气流速为12 mL·min-1，干燥气温度350℃，质量扫描范围：100~1000  amu。

（4）NMR：Bruker 400 Ultra-ShieldTM超导脉冲傅立叶变换核磁共振仪。H-NMR和C-NMR：以氘代水为溶剂，丙酮为内标进行测定。

2 结果与分析

2.1 5种茶样“散茶发花”茯茶样品

按照“散茶发花”的技术要求将各茶类原料加水至相同最终含水量，接以相同剂量的冠突散囊菌，放置培养箱控温控湿培养10 d，“发花”结束后置于70℃恒温干燥箱中4 h，取出封存。比对各茶样“发花”的茯茶实物图（图1）发现，相同剂量和相同时间处理的“发花”茶样均“金花”满披，除外观形态有细微差别外，其他并无表现出明显差异。

2.2“散茶发花”茯茶“发花”前后差异化合物HPLC图谱叠加比对分析

按照1.6.1的HPLC方法进样分析，经HPLC图谱比对分析，结果发现5种茶样发花前后的差异化合物表现出一致性（图2~图6），同时分别在保留时间45.9 min和49.3 min左右新增两个峰，且5种“发花”处理样品中新增的两个目标化合物在保留时间上呈现高度一致（图7），这说明采用不同茶叶原料进行相同“发花”处理，最终形成了相同的差异化合物。

2.3 差异化合物制备

按照方法1.6.2对“发花”10 d的茶样进行制备色谱分离制备，所得色谱图如图8所示，结果表明，在保留时间为12.5 min（差异化合物1）和22.5 min（差异化合物2）处分别检测到单一流分，随即分别对这两处流分进行收集，再经旋转蒸发仪在30℃水浴下浓缩以去除有机溶剂，最后再进行冷冻干燥并保存。

2.4 差异化合物结构鉴定

按照方法1.6.1，分别对所得流分1和2进行分析型HPLC进样分析，所得色谱图如图9、图10所示，结果表明，在保留时间为45.794 min和49.299 min处分别检测到差异化合物1和差异化合物2，并将所得两个化合物作HR-MS和NMR检测分析。

根据化合物1和2的类别判断可知，二者均为黄酮类化合物，化合物1，C15H11O7，淡黄色无定型粉末，MS，/：303.0500，[M+H]+（图11）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz)d7.73 (1H, d,= 1.8 Hz, H-11)，7.63 (1H, dd,= 8.0 Hz, H-15)，6.88 (1H, 1H, d,= 8.0 Hz,H-14)，6.38 (1H, d,= 1.8 Hz H-8)，6.18 (1H, d,= 1.8 Hz, H-6)，13C NMR (CD3OD, 125M Hz)d177.5 (C-3)，165.7(C-7)，162.6 (C-5)，158.4 (C-9)，148.9 (C-13)，148.2 (C-1)，146.3 (C-12)，137.3 (C-2)，124.3 (C-10)，121.8 (C-15)，116.4 (C-14)，116.1(C-11)，104.6 (C-4)，99.4 (C-6)，94.5 (C-8)，经与文献对照[11-13]，以上数据与槲皮素基本一致，结构式见图12，化合物1的关键HMBC二维核磁相关见图13。

化合物2，C15H11O6，淡黄色无定型粉末，MS,/: 287.0553, [M+H]+（图14）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz)d8.09 (2H, d,= 8.0 Hz, H-11, H-15)，6.90 (2H, d,= 8.0 Hz, H-12, H-14)，6.40 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8)，6.18 (d,= 1.8 Hz, H-6)，13C NMR (CD3OD, 125M Hz)d177.5 (C-3)，165.8(C-7)，162.6 (C-5)，160.7 (C-13)，158.48 (C-9)，148.2 (C-1)，116.4 (C-14)，

116.4 (C-12)，137.2 (C-2)，130.8 (C-15)，130.8(C-11)，123.9 (C-10)，104.7 (C-4)，99.4 (C-6)，94.6 (C-8)。经与文献对照[12-14]，以上数据与山奈酚基本一致，结构式见图15，化合物2的关键HMBC二维核磁相关见图16。同时结合两种化合物的高效液相色谱图，其保留时间分别与标准品槲皮素、山奈酚均一致，见图17。因此将目标差异化合物分别鉴定为槲皮素（化合物1）和山奈酚（化合物2）。

3 讨论

从传统的茯砖茶到多样化的现代化茯茶的演变，经历了加工工艺的改善与简化，生产效率的提高，质量可控性的加强，产品形式的增加，消费者饮用方式的改变与产品价值的提升，同时工艺的改进使研究者们能够更加便捷地获得特定茶叶原料制茯茶，甚至非茶叶原料

制发花试验材料[15]，茯茶“散茶发花”技术的应用为以冠突散囊菌为供试发酵真菌对特定植物材料或功能性生化成分的微生物代谢、生物转化研究及功能性真菌发酵食品的开发奠定了基础。

茯茶因其独特的加工工艺、风味品质与突出的保健功效而闻名于世，独有的“发花”工艺与成品茶中的优势“金花”菌使现代茯茶形成了区别于其加工原料的特有的品质风味与保健功效，其实质是“金花”菌通过在发酵过程中分泌复杂多样的孢外酶以及微生物热，直接或者间接利用茶叶生化成分作为满足其生长、繁殖需要的营养基础[16]，期间发生一系列复杂的生化反应，一方面形成了茯茶特异的风味品质，另一方面“金花”菌以茶叶功能成分为代谢基质或代谢出性质更为全面或功能更强的生化成分。

因此，“发花”处理的茯茶成品中特异性功能成分的寻找成了研究者们关注的重点，本研究运用现代化茯茶加工新技术的便捷性，分别以不同茶类原料制茯茶的“发花”（真菌固体发酵）前后茶样为研究对象，对“发花”前后的茶样经HPLC图谱叠加比对分析，寻找“发花”前后主要差异化学成分，并运用制备色谱制备目标差异化合物，经HR-MS和NMR技术对其进行初步鉴定，结果表明，在本研究的分离条件下，不同性质的茶叶原料经相同“发花”处理，与其对应原料相比，各组形成的差异化学成分表现出高度一致性，差异化学成分均为黄酮醇化合物，分别为槲皮素和山奈酚。

黄酮类化合物因分子中有酚羟基而显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中；黄酮类化合物分子中γ-吡喃酮环上的1-位氧原子因有未共用的电子对，所以表现出微弱的碱性，其溶解度也因结构不同而具有很大的差异，黄酮苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂和稀碱液中，而黄酮类化合物通常以黄酮糖苷的形式存在于茶叶中，因此本研究在各茶叶原料HPLC图谱中未找到两种目标黄酮醇化合物，经“发花”处理后，实质可能是在微生物分泌的酶和热的作用下将原本以黄酮苷形式存在于茶叶中的黄酮类化合物经水解作用形成了黄酮醇化合物，从而在不同茶类“发花”制品的HPLC图谱中检测到相同的两种差异黄酮醇化合物，此研究结果可能为“发花”茯茶的突出保健功效提供一定的理论基础。

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Isolation and Identification of Variant Phytochemical in the Processing of Fu Tea by Fungal Fermentation with Loose Tea

HUANG Hao1,2,3, ZHAO Xi1, HUANG Huaisheng1, YIN Xia1, SU Benwen1, ZHONG Xinggang1, HUANG Jian’an2,3, ZHENG Hongfa1*, LIU Zhonghua2,3*

1. Hunan Tea Research Institute, Changsha 410125, China; 2. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China

Several kinds of Fu tea were obtained by the technology of “fungal fermentation with loose tea” with different tea samples such as Dahongpao tea, black tea, green tea, the raw material of Tianjian tea and the raw material of Jinxiangyi brick tea. With different properties of tea samples (fungal solid state fermentation) generated from “fungal fermentation” as the research objects, this article has searched the main variant phytochemical through comparative analysis with the help of HPLC overlay method. Meanwhile, targeted variant compounds have been constructed with preparative HPLC with preliminary identification by HR-MS and NMR. The experiment indicated that under the detached condition of this study, different kinds of Fu tea generated the same compounds after “fungal fermentation”. And the two added variant compounds are flavonols, named quercetin and kaempferol respectively.

Fu tea, fungal fermentation with loose tea, variant compounds, flavonols,quercetin, kaempferol

TS272.5+4；Q946.84+1

A

1000-369X（2016）01-027-11

2015-06-02

2015-08-12

国家自然科学基金（31471706）、现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23）、湖南省茶叶研究所所长基金（2015SJ01）。

黄浩，男，博士，主要从事茶叶加工及功能成分研究。*通讯作者