乳酸菌发酵提高麦胚可溶性蛋白和总酚含量及抑制脂质体氧化能力的研究

伍 娟，曾晓娇，程 宇，董 英（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

乳酸菌发酵提高麦胚可溶性蛋白和总酚含量及抑制脂质体氧化能力的研究

伍 娟，曾晓娇，程 宇，董 英
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

以可溶性蛋白及总酚含量为指标，在单因素实验基础上，采用正交实验设计优化乳酸菌发酵麦胚的条件，并考察了发酵产物在脂质体体系下的抗氧化能力。结果表明，起始pH影响显著，可溶性蛋白和总酚累积的最适发酵条件分别为pH5.0、VB6浓度150 μmol/L、发酵时间12 h、发酵温度35℃及pH5.0、VB6浓度100 μmol/L、发酵时间36 h、发酵温度35℃。在优化条件下，麦胚发酵产物水溶性组分中蛋白及总酚含量分别为24.86 mg/mL和0.876 mg/mL，比原料提高了1.74和1.45倍。同时，乳酸菌发酵提高了麦胚水溶性组分抑制脂质体氧化的能力，其脂质体氧化抑制率可达45.5%。通过对·OH清除及对Fe2+螯合能力的实验表明，麦胚发酵产物抑制脂质体氧化的能力与其羟基自由基清除能力有关。

麦胚，乳酸菌，发酵，可溶性蛋白，总酚，脂质体氧化

开发麦胚为原料的食品或是从麦胚中提取胚芽油是麦胚综合利用的主要途径［1］。而近年来麦胚的微生物转化则为小麦制粉副产物的麦胚提供了一条新的综合利用途径［2-3］。由于麦胚营养成分丰富，利用微生物的生物传化作用不仅可以改善其营养价值，还可以提高其功能性，如抗肿瘤和抗氧化活性等［2-4］。其中，利用微生物如酵母和乳酸菌的生物转化作用提高麦胚抗肿瘤活性的研究较多，而利用微生物生物转化作用改善麦胚抗氧化活性的研究则较少。Dordevic＇等［4］的研究表明，麦胚经乳酸菌发酵后其抗氧化活性得到了提高，这与麦胚乳酸菌发酵产物中总酚含量的增加有一定正相关性。本课题组前期的研究也表明以麦胚蛋白为原料进行酶水解能提高麦胚蛋白的抗氧化活性［5-6］。由于蛋白酶水解物和多酚类化合物已是公认的天然抗氧化物质，因此麦胚经乳酸菌发酵后生成的可溶性蛋白（多肽）及多酚则可能是其实现抗氧化功能的物质基础。因而，利用微生物的内源酶提高麦胚发酵产物中多酚含量并同时提高可溶性蛋白（多肽）的转化率就有可能进一步改善麦胚的功能性质。

在前期的研究中，课题组利用分离的植物乳杆菌发酵麦胚提高了脱脂麦胚中γ-氨基丁酸的含量［7］，但是对乳酸菌发酵麦胚的抗氧化功能还未了解。目前，国内对乳酸菌发酵麦胚的研究还不多。本研究拟在前期研究所探讨的单因素基础上，通过正交实验设计考察影响发酵产物水溶性组分中的可溶性蛋白和总酚含量的变化以及其体外抗氧化活性的因素，以此探讨麦胚乳酸菌生物转化产物作为天然抗氧化功能配料的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）直投式发酵剂 实验室自制，活菌数为5～7×1010cfu/g；脱脂麦胚 安阳漫天雪食品制造有限公司；Ferrozine Sigma-Aldrich公司，分析纯；福林酚试剂、牛血清清蛋白、没食子酸标准品、硫代巴比妥酸、BHA及其他试剂 中国医药（集团）上海化学试剂有限公司，分析纯；实验用水 自制，纯水。

UV-1801紫外/可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；TG16－WS台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；雷磁pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；HG15A高速乳化均质机 大韩科学株式会社；KQ2200DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FM摇床 上海福玛实验设备有限公司；

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验 参考前期研究［7］。在250 mL锥形瓶中取一定量麦胚（10 g）、乳酸菌（加菌量为麦胚的4%）和吡哆素（100 μmol/L）溶于50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲盐（pH4.2），料液比为1/7（g/mL），纱布封口锥形瓶后将其放在摇床（100 r/min）中发酵（35℃、24 h），发酵结束后5000 r/min离心发酵液15 min，取上清液保存于4℃备用。在此基础上，每次改变一个单因素条件考察单因素，包括发酵温度（25、30、35、40℃）、发酵起始pH（pH3.5、4.0、4.2、4.5、5.0）、吡哆素添加量（0、50、100、150、200 μmol/L）、发酵时间（0、12、18、24、30、36 h）、以及缓冲盐种类（醋酸-醋酸钠、柠檬酸-磷酸氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠）对麦胚发酵产物水溶性组分中蛋白和总酚含量的影响。

1.2.2 发酵条件优化及验证 在单因素实验基础上，以可溶性蛋白和总酚含量为评价指标，选取发酵时间、吡哆素以及起始pH三个因素，采用L9（34）正交实验设计优化可溶性蛋白和总酚累积的发酵条件（发酵温度35℃，醋酸-醋酸钠缓冲体系）。同时，测定不同实验条件得到的发酵产物抑制脂质体氧化能力，分析麦胚发酵产物中可溶性蛋白和总酚含量与脂质体抑制能力之间的相关性。正交实验的因素水平表见表1，各因素三个水平按随机顺序排列［8-9］。

表1 正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白、总酚含量的测定 可溶性蛋白含量测定采用双缩脲法［10］，总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法［11］。

1.2.4 脂质体的制备及氧化实验 以稀释5倍的发酵上清液为待测样品，参考张欣等［12］的方法。

1.2.5 麦胚发酵产物水溶性组分亚铁离子螯合能力的测定 以稀释5倍的发酵上清液为待测样品，BHA为对照，参照Wang等的方法［13］。

1.2.6 麦胚发酵产物水溶性组分羟自由基清除能力测定 以稀释5倍的发酵上清液为待测样品，BHA为对照，参照Li等的方法［14］。

1.2.7 统计分析 所有实验在不同时间经过两次以上重复（n≥2），每次重复实验进行三次平行实验，实验所得数据进行方差分析，统计软件为DPS。

2 结果与讨论

2.1 缓冲体系对麦胚发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和多酚累积的影响

由于乳酸菌发酵会累积乳酸，这会导致发酵过程发酵液的pH的下降，为维持体系的pH则需要采用缓冲体系，而不同的缓冲体系具有不同的缓冲能力，因此选择合适的缓冲体系有利于麦胚蛋白的转化和水溶性多酚的累积。不同缓冲盐对麦胚乳酸菌发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和总酚累积的影响如图1所示。研究结果表明，缓冲盐为醋酸-醋酸钠时麦胚发酵产物中的可溶性蛋白含量和其他两种缓冲盐相比较低（p＜0.05）。但是实验所用三种缓冲体系得到的麦胚发酵产物中的总酚含量则没有显著差异（p＞0.05）。由于醋酸-醋酸钠缓冲体系具有更宽的缓冲范围［15］，且有利于麦胚中其他活性物质如γ-氨基丁酸的累积［7］，因而在后续实验中选择醋酸-醋酸钠缓冲体系用于pH的控制。

图1 缓冲盐对麦胚发酵液中蛋白和总酚含量的影响Fig.1 Effect of buffer on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.2 发酵温度对麦胚发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和多酚累积的影响

发酵温度对麦胚乳酸菌发酵产物中蛋白和总酚含量的影响如图2。从图2可以看出，随着发酵温度的升高，发酵液中可溶性蛋白和总酚含量虽均有所增加，但并不存在显著性差异（p＞0.05）。发酵温度达35℃时，发酵液中可溶性蛋白含量达最大；温度进一步提高到40℃，发酵液中的可溶性蛋白含量并没有进一步的增加，但总酚含量略有增加。尽管温度升高可以促进酶反应的速率，但温度过高则可能不利于乳酸菌生长，从而破坏细胞的酶活力，不利于蛋白和多酚的累积。从实验结果可以看出当发酵温度达35℃时，发酵液中多酚和可溶性蛋白的累积均较好，因而在后续的研究中选择35℃作为发酵温度进行实验。

图2 发酵温度对麦胚发酵液中蛋白和总酚含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.3 起始pH对麦胚发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和多酚累积的影响

图3 起始pH对麦胚发酵液中蛋白和总酚含量的影响Fig.3 Effect of initial pH on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

由于可溶性蛋白和多酚的累积需要乳酸菌内源及外源酶的作用，而pH则是酶作用的重要影响因素之一，因此实验利用50 mmol/L的醋酸缓冲液将麦胚发酵的起始pH控制在一定范围考察起始pH对麦胚乳酸菌发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和多酚含量的影响，结果如图3所示。初始pH为3.5、4.2和5.0时，发酵液中总酚含量较低而可溶性蛋白含量较高，初始pH为4.0和4.5时，发酵液中总酚含量较高而可溶性蛋白含量却较低。这可能是由于pH对乳酸菌内源和外源蛋白酶以及将键合多酚从麦胚基质中释放出来的水解酶的活性有不同影响有关。由于醋酸缓冲液的缓冲范围为pH3.6～5.6［15］，因此选择pH4.0、4.5和5.0作为正交实验pH的三个水平。

2.4 吡哆素对麦胚发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和多酚累积的影响

吡哆素即VB6，通常作为辅酶参与生物的物质代谢来发挥其主要功能。VB6对麦胚乳酸菌发酵产物中蛋白和总酚含量的影响见图4。实验结果表明，和未添加VB6的样品相比，添加VB6可以显著提高麦胚乳酸菌发酵产物水溶性组分中的总酚含量（p＜0.05）。添加浓度为100 μmol/L VB6进行发酵后，发酵产物水溶性组分中的可溶性蛋白含量能得到显著提高（p＜0.05），达20.4 mg/mL，为不添加VB6时的1.28倍。此时总酚含量为0.66mg/mL，为不添加VB6时的1.34倍。添加VB6能提高麦胚发酵产物水溶性组分中多酚及可溶性蛋白含量，这可能与添加VB6提高了相关酶的酶活力有关。通常增加辅酶的含量有利于酶活力的提高，因此正交实验中吡哆素的三个水平选择100、150、200 μmol/L。

图4 VB6的添加对麦胚发酵液中蛋白和总酚含量的影响Fig.4 Effect of VB6concentration on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.5 发酵时间对麦胚发酵产物水溶性组分中可溶性蛋白和多酚累积的影响

脱脂麦胚经乳酸菌发酵不同时间后，测定其发酵产物水溶性组分中蛋白和总酚的含量，结果如图5所示。从图5中可以看出，麦胚经乳酸菌发酵后，其发酵产物水溶性组分中总酚及可溶性蛋白含量与未发酵麦胚相比均有一定程度增加（p＜0.05）。发酵36 h时，发酵液中总酚含量达到0.84 mg/mL，约为0 h时的2倍。发酵18 h时，发酵上清液中可溶性蛋白含量达20.8 mg/mL，约为0 h时的1.7倍（p＜0.05）。发酵时间继续增加至30、36 h则会导致发酵液中可溶性蛋白含量的下降，这可能是由于部分多肽继续降解为氨基酸有关。在发酵过程中，麦胚蛋白在乳酸菌分泌蛋白酶的作用下水解成多肽和小肽，小肽在肽酶作用下被水解生成游离氨基酸［16］。因而，随着发酵时间的延长，发酵液中可溶性蛋白含量呈现先升后降的趋势。实验结果表明乳酸菌发酵能够显著提高麦胚水溶性组分中可溶性蛋白和总酚的含量，这与Dordevic等［4］的研究结果类似。尽管在前发酵24 h内，发酵时间为18 h时可溶性多酚和蛋白含量都较高，但是发酵24 h 和18 h的样品中可溶性蛋白含量没有显著性差异（p＜0.05）。同时，虽然增加发酵时间不利于可溶性蛋白含量的提高，但是可以增加水溶性总酚的含量。因选择发酵时间12、24、36 h用于正交实验。

图5 发酵时间对麦胚发酵液中蛋白和总酚含量的影响Fig.5 Effect of fermentation time on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.6 正交实验

由于醋酸缓冲盐体系有利于麦胚多种功能性组分的累积，而发酵温度35℃接近乳酸菌适宜生长的温度，并且发酵时间、吡哆素以及起始pH对麦胚中可溶性蛋白和多酚含量有一定影响，实验选择发酵时间、吡哆素以及起始pH三个因素进行优化。为了减少实验误差对优化结果判断的影响，在进行正交实验设计时，除了以空白列为误差列对实验误差进行分析，还对不同组合下的实验进行了两次重复（Y11和Y12、Y21和Y22、Y31和Y32分别为两次重复实验的可溶性蛋白含量、多酚含量以及脂质体氧化抑制率）。在进行数据分析时，将误差列产生的误差和重复实验的误差合并用于实验结果的分析。正交实验结果和直观分析结果如表2所示。正交实验方差分析结果如表3～表5所示。

对于可溶性蛋白积累，由表2的直观分析结果可知，实验各因素对可溶性蛋白含量影响的效应值大小为起始pH＞VB6＞发酵时间，最优实验方案为起始pH5.0、VB6浓度150 μmol/L、发酵时间12 h。表3方差分析结果表明起始pH对可溶性蛋白含量影响显著（p＜0.05）。实验的较优组合在正交表中，在此最优组合条件下增加1次重复实验，得到发酵液中可溶性蛋白含量为24.86 mg/mL，高于正交实验均值（24.19 mg/mL），可见优化条件合理。优化条件下得到的发酵液对脂质体氧化的抑制率为25.1%。

对于水溶性多酚的积累，由表2的直观分析结果可知，实验各因素对总酚含量影响的效应值大小为发酵时间＞起始pH＞VB6，实验较优参数组合为pH5.0、VB6浓度100 μmol/L、发酵时间36 h。表4方差分析表明发酵时间和起始pH对总酚含量都有极显著影响（p＜0.01），其中发酵时间的影响更为显著。实验的较优组合没有出现在正交表中，因此在最优组合条件下进行3次重复实验，得到发酵液中总酚含量为0.876 mg/mL，比正交实验结果中最高组的总酚含量（0.869 mg/mL）高，可见优化条件合理。优化条件下得到的发酵液对脂质体氧化的抑制率为29.9%。

表2 正交实验结果Table2 Results of orthogonal experiment

对于脂质体抑制能力，由表2的直观分析结果可知，实验各因素对脂质体氧化抑制率影响的效应值大小为起始pH＞VB6＞发酵时间，实验较优参数组合为起始pH5.0、VB6浓度100 μmol/L、发酵时间12 h。表5的方差分析结果表明起始pH对脂质体氧化抑制率影响显著（p＜0.05）。实验的较优组合没有出现在正交表中，因此在最优组合条件下进行3次重复实验，得到发酵液水溶性组分的脂质体氧化抑制率为45.5%，比正交实验结果中最高组的脂质体氧化抑制率（均值44.1%）高，可见优化条件合理。正交实验表中第7号实验结果为负值，这表明这一条件下得到的发酵产物可能有弱的促进脂质体氧化的作用。

表3 可溶性蛋白正交实验方差分析结果Table3 Variance analytical results of soluble protein orthogonal experiments

表4 总酚正交实验方差分析结果Table4 Variance analytical results of polyphenols orthogonal experiments

表5 脂质体氧化抑制率正交实验方差分析结果Table5 Variance analytical results of liposome oxidation inhibition rate orthogonal experiments

2.7 麦胚发酵产物水溶性组分的体外抗氧化活性

尽管用不同指标得到的最优组合不同，但是以脂质体氧化抑制率为指标优化得到的麦胚发酵液对脂质体氧化的抑制率高于可溶性蛋白含量以及总酚含量为指标优化得到的麦胚发酵液，前者对脂质体氧化的抑制率分别比后两者高44.8%和34.2%。为进一步明确麦胚发酵产物的抗氧化作用，对脂质体氧化抑制率为指标优化得到的麦胚发酵液亚铁离子螯合能力以及自由基清除能力进行了分析，结果见表6。与未发酵样品相比，麦胚发酵产物抑制脂质体氧化的能力提高了0.6倍，并且其抑制脂质体氧化的能力与0.01 mg/mL BHA相当。此时发酵产物水溶性组分的羟自由基清除率为45.1%，比未发酵样品的羟自由基清除率提高了1.1倍。但发酵样品的Fe2+螯合能力同未发酵样品相比，并没有得到提高，这可能与水溶性组分中麦胚蛋白的降解有关，蛋白经酶解后Fe2+螯合能力可能降低［13］。由上可推测清除自由基能力是麦胚发酵产物抑制脂质体氧化的重要机制之一。

表6 麦胚发酵液的抗氧化能力Table6 The antioxidant ability of fermented wheat germ extract

进一步利用SPSS中的相关性分析程序分析可溶性蛋白含量、多酚含量与脂质体氧化抑制率之间的相关性，结果表明它们之间几乎无相关性，因此分析麦胚发酵产物水溶性组分抑制脂质体氧化不仅与多酚和蛋白含量有关，更可能与多酚的种类以及蛋白的分子量分布、氨基酸组成等参数相关。

3 结论与讨论

乳酸菌发酵可提高麦胚水溶性组分中可溶性蛋白、总酚含量，其中发酵起始pH对以上两者有显著影响（p＜0.01）。麦胚发酵产物在醋酸缓冲体系中可溶性蛋白和总酚累积的较优发酵条件分别为：pH5.0、VB6150 μmol/L、发酵时间12 h、发酵温度35℃，pH5.0、VB6100 μmol/L、发酵时间36 h、发酵温度35℃。得到的可溶性蛋白和总酚含量分别为24.86 mg/mL和0.876 mg/mL，比原料提高了1.74和1.45倍。其中，可溶性蛋白是以水解蛋白的形式存在。而前人的研究表明，水解蛋白和多酚类化合物作为公认的天然来源抗氧化剂，能够在模拟或真实的食品体系中抑制油脂氧化，但两者的联用可能产生加成甚至是协同增效的抗氧化效应［17］，也有可能产生拮抗效应［18］。本文表明乳酸菌发酵可以提高麦胚的脂质体氧化抑制能力。虽然麦胚发酵产物水溶性组分抗氧化能力与其羟自由基清除能力存在较好的对应关系，但是脂质体氧化抑制率与麦胚发酵产物中蛋白和多酚含量之间无显著相关性。这表明，同时含有水解蛋白和多酚类物质的麦胚发酵产物水溶性组分尽管表现出一定的抗氧化效应，但其作用方式尚不明确，有待进一步研究。

脂质体是天然磷脂在水中分散形成的磷脂双分子层结构，其不饱和脂肪酸酰基链上的双键易被氧化，因而是一个研究天然来源抗氧化剂抗氧化作业的有效模型［19］，已被许多研究用于食品组分抗氧化性质的评价［17，20］。本文研究表明，脱脂麦胚经一定条件的乳酸菌发酵后，其产物水溶性组分在模拟食品体系中能较好地抑制脂质体氧化，可见脱脂麦胚乳酸菌转化产物具有潜在的抑制油脂氧化的能力，这为开发其作为天然的抗氧化功能配料提供了理论依据，同时也为麦胚的综合利用开辟了一个新的思路。

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Study on using lactic acid bacteria improve the content of soluble protein and total phenol of wheat germ and its ability to inhibit oxidation of liposome

WU Juan，ZENG Xiao-jiao，CHENG Yu，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

On the basis of single factor trials，optimized fermentation conditions of wheat germ fermented by lactic acid bacteria were investigated using orthogonal experiment.The content of water-soluble protein and total polyphenols in fermented wheat germ was used as indicators in these trials.And the ability of fermented wheat germ to inhibit liposome oxidation was investigated.The results showed that the content of soluble protein and total polyphenols were significantly influenced by initial pH.The optimal conditions for the soluble protein content were indicated as initial pH5.0，vitamin B6concentration 150 μmol/L，fermentation time 12 h and fermentation temperature 35℃.While the optimal conditions for the total polyphenols content were indicated as initial pH5.0，vitamin B6concentration 100 μmol/L，fermentation time 36 h and fermentation temperature 35℃.The concentration of soluble protein and polyphenols in optimal conditions were 24.86 mg/mL and 0.876 mg/mL respectively，which increased by 1.74 times and 1.45 times respectively when compared with raw materials.Meanwhile，the ability of the water-soluble components of wheat germ in retarding liposome oxidation was increased by lactic acid fermentation with the inhibition rate of 45.5%.The results of·OH scavenging capacity and Fe2+chelating capacity showed that the ability of fermented wheat germ to retard liposome oxidation was related with its·OH scavenging capacity.

wheat germ；lactic acid bacteria；ferment；soluble protein；total polyphenols；liposome oxidation

TS210.9

A

1002-0306（2016）06-0233-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.040

2015－08－19

伍娟（1982-），女，博士研究生，研究方向：食品组分营养功能与生物活性，E-mail：wjfood23@163.com。

江苏省产学研前瞻性联合研究项目（BY2012172）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（CXLX12_0672）；江苏省自然科学基金（BK20130494）；江苏大学“骨干青年教师培养工程”。