慢性心房颤动降低 Junctophilin-2在心房中的表达研究*

李妙龄，欧贤红，李　涛，毛　亮，杨　艳，曾晓荣

(西南医科大学心血管医学研究所，四川泸州 646000)



慢性心房颤动降低 Junctophilin-2在心房中的表达研究*

李妙龄，欧贤红，李涛，毛亮，杨艳，曾晓荣△

(西南医科大学心血管医学研究所，四川泸州 646000)

目的明确在慢性心房颤动(AF)中Junctophilin-2(JPH2)表达变化及意义。方法从心脏外科体外循环手术中获取21例窦性心律(SR)患者和30例慢性AF患者右心房肌组织，采用免疫组织化学方法测定心房肌组织JPH2蛋白的分布；实时荧光定量PCR法检测心房肌JPH2 mRNA水平；Western blot测定人心房肌JPH2蛋白水平。结果免疫组织化学实验发现SR组与AF组心房肌组织上均存在JPH2蛋白表达，SR组着色更明显；AF组心房肌JPH2 mRNA水平和蛋白水平均明显低于SR组(P<0.01)。结论慢性AF患者心房肌JPH2的表达下调可能与心房肌细胞内钙紊乱密切相关。

心房颤动；心房；钙；Junctophilin-2

心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床最为常见的持续性心律失常，有较高的发病率和致死率，临床治疗效果欠佳，药物治疗还可增加室性心律失常的发生率[1]。细胞内钙处理异常被认为是心房功能紊乱的最主要原因[2]。Junctophilins(JPHs)是新近发现存在细胞膜L型钙通道(LTCC)与肌浆网RyR2间的膜耦联复合物，是可兴奋细胞参与细胞内钙信号转导的重要亚细胞结构[3]。JPHs包括4种亚型JPH1、JPH2、JPH3和JPH4，心肌上主要表达JPH2。有研究发现小鼠心脏JPH2基因沉默可导致肌浆网钙泄漏而致心力衰竭[4]，而在AF心肌中JPH2会发生怎样的改变，目前还不清楚。

1　资料与方法

1.1一般资料所取标本来源于2013年3～11月本院胸心外科体外循环手术患者右心房肌组织，包括窦性心律(SR)21例和慢性AF患者30例，术前所有患者均签署了知情同意书，并获得医院伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学取SR组5例和AF组5例患者右心房组织用于免疫组织化学染色。标本从术中取回后经10%福尔马林固定后制作蜡块后切片，给予JPH2 一抗(Abcam公司,1∶200)孵育过夜，二抗(HRP 1∶2 000)孵育30 min。应用二氨基联苯胺显色，并在显微镜下观察，显色后5 min，复染再脱水，用中性树胶封片。细胞膜和胞质呈现二氨基联苯胺棕黄色着色为表达阳性。

1.2.2实时荧光定量PCR法测定人心房JPH2 mRNA表达水平JPH2：上游引物5′-CTT TGA GGT GGC AGG TGT CTA-3′,下游引物5′-ATT CCG TAG CGT CCC TTG A-3′； β-actin：上游引物5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG-3′，下游引物 5′-TGT CAC GCA CGA TTT CC-3′。Trizol法提取心房肌总RNA，采用ReverTra-Plus扩增试剂盒从1 μg总RNA中逆转录合成cDNA，所得cDNA以SYBR®Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO) 进行扩增，以β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.2.3Western blot检测JPH2蛋白水平将心脏手术中取回的心房肌标本于PBS液中去除血液，剪去结缔组织及脂肪组织后，放入预先标记好的EP管中于-80 ℃冻存备用。收集齐标本后(SR组16例，AF组25例)于冰上冻融并剪成小块(1 mm ×1 mm ×1 mm),加入裂解液20 mg/100 μL间断匀浆2 min，至无明显颗粒后，在超声波下处理3次，每次10 s。随后于冰上裂解30 min，再以10 000 r/min 4 ℃条件下离心10 min取上清液。取少量上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒按使用说明测定蛋白质浓度。以每孔25 μg蛋白量进行SDS-PAGE电泳，先以80 V电容40 min，再以100 V电泳120 min，电泳完成后再转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，经5%脱脂奶粉封闭1 h后，用JPH2一抗(Abcam 1∶500)和GAPDH一抗(1∶2 000)孵育过夜，隔日用辣根过氧化酶标记的二抗(1∶10 000)孵育，采用化学荧光(罗氏)显影。

2　结　　果

2.1临床资料特征持续性AF患者持续时间均大于6个月。AF组左房直径明显大于SR组，心功能Ⅳ级患者多于SR组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2免疫组织化学法测定JPH2在人心房中的分布SR组心肌排列明显比AF组有规律，呈条索状排列；从组织着色可以看出SR组和AF组心房肌上均存在JPH2的表达，且SR组患者的棕黄色颗粒明显多于AF组。见图1。

2.3两组心房肌JPH2 mRNA水平根据图像成像扫描，在196 bp和142 bp处分别观察到JPH2和β-actin扩增引物，以SR组与AF组心房肌JPH2/β-actin的比值为1.00±0.21 vs.0.38±0.04(P<0.01)，经统计分析表明AF组心房肌JPH2 mRNA表达水平比SR组明显降低了(61.9±3.6)%。

2.4两组心房肌JPH2蛋白水平根据显影灰度值定量分析JPH2与GAPDH比值，经统计SR组与AF组的比值为1.35±0.38 vs.0.62±0.21(P<0.01)。结果显示与SR组相比，AF组JPH2降低了(54.2±4.61)%。见图2。

表1　患者资料

*：P<0.05,△：P<0.01，与SR组比较。

A:SR组(×200);B:AF组(×200);C:SR组(×400);D:AF组(×400)。

图1人心房肌JPH2免疫组织化学染色结果

A:JPH2蛋白印迹原始图;B:标准化的JPH2蛋白的表达水平。

图2两组心房肌JPH2蛋白水平

3　讨　　论

本实验结果表明，JPH2均广泛分布于SR和慢性AF患者心房肌组织中。与SR患者相比，从组织水平、基因和蛋白水平均证明了慢性AF患者心房肌JPH2表达明显下调，表明AF改变了JPH2的正常功能，可能参与了AF的发生和维持。

JPHs是新近发现存在于可兴奋细胞膜与肌浆网之间的膜耦联蛋白，使二者保持在一个较近的距离[4]，有利于细胞膜与肌质膜之间的信号转导，在兴奋-收缩耦联过程中发挥重要作用。JPHs在哺乳动物中有多种亚型分布，JPH2主要分布在心肌上，JPH2位于细胞膜L型钙通道与肌浆网RyR间的连接蛋白，对细胞内钙稳态调控中发挥重要作用[5-6]。在生理状态下，JPH2在心肌超微结构形成和对心脏负荷的反应中起到重要保障作用。JPH2功能调节异常与多种心血管疾病相关，目前对于JPH2功能异常对心脏的损害主要集中在心肌肥大及与心力衰竭的相关性研究。研究发现心肌肥大可引起JPH2表达下调，同样心肌JPH2基因沉默可降低心肌兴奋-收缩耦联和细胞内钙稳态[7]。JPH2过表达不能增强其基本功能，但能缓解向心力衰竭的发展[8]。在心力衰竭心肌细胞上[9]，心脏负荷可导致JPH2的转运异常，JPH2失去在T管/Z线区域的正常定位，导致其在细胞膜上的重新分布。

不正常的细胞内钙处理在心房颤动的发生与维持中发挥重要作用。本研究中发现JPH2在AF时明显下调，这表明AF使JPH2 功能下调，心房肌兴奋-收缩脱耦联，兴奋收缩偶联效率降低，细胞内钙调节紊乱，进而影响心房肌的收缩功能。有研究发现[10]，JPH2突变E169K可导致阵发性AF或室上性心动过速的发生，可能与其损害细胞内钙调节相关。进一步研究发现在HL-1细胞上[11]，JPH2突变S101R,Y141H或S165F使细胞自发性钙释放的幅度和频率均明显降低。舒张期肌浆网钙泄漏是AF的重要病理机制之一。研究发现[10]，降低JPH2表达可通过直接增加RyR2开放概率和间接降低钠钙交换体活性，进而增加肌浆网钙泄漏，促进心力衰竭的发展。这也间接表明AF时JPH2表达下调可能通过增加钙泄漏而促进AF的发展。

最新研究发现[10]，JPH2错义突变降低了JPH2与RyR2间的结合比率，使RyR2功能受损导致舒张期肌浆网钙泄漏和房性心律失常，这表明了JPH2可能是治疗AF的潜在靶点。与此同时在同一期杂志上另有课题组也证明JPH2在稳定RyR2功能中发挥重大作用，也同时证明了JPH2功能异常参与了AF钙泄漏过程。本结果也支持了JPH2表达下调参与了AF病理生理机制的调节，为探索AF的潜在治疗靶点提供理论依据。

[1]European Heart Rhythm A,European Association for Cardio-Thoracic S,Camm AJ,et al.Guidelines for the management of atrial fibrillation:The task force for the management of atrial fibrillation of the european society of cardiology(esc)[J].Eur Heart J,2010,31(19):2369-2429.

[2]Wakili R,Yeh YH,Yan Qi,et al.Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs[J].Cir Arrh Electrophysiol,2010,3(6):530-541.

[3]Nishi M,Mizushima A,Nakagawara K,et al.Characterization of human junctophilin subtype genes[J].Bioc Biophysical Res Commu,2000,273(10):920-927.

[4]Jayasinghe ID,Baddeley D,Kong CH,et al.Nanoscale organization of junctophilin-2 and ryanodine receptors within peripheral couplings of rat ventricular cardiomyocytes[J].Biophysical J,2012,102(1):19-21.

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[9]Zhang C,Chen B,Guo A,et al.Microtubule-mediated defects in junctophilin-2 trafficking contribute to myocyte transverse-tubule remodeling and Ca2+handling dysfunction in heart failure[J].Circulation,2014,129(20):1742-1750.

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Down-regulation of Junctophilin-2 in human atrial from patients with chronic atrial fibrillation*

Li Miaoling,Ou Xianhong,Li Tao,Mao Liang,Yang Yan,Zeng Xiaorong△

(Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo cxplore the change and significance of Junctophilin-2(JPH2) expression in chronic atrial fibrillation(CAF).MethodsRight atrial muscle tissue of 21 patients with sinus rhythm (SR) and 30 patients with chronic atrial fibrillation (AF) were obtained from cardiopulmonary bypass surgery.The distribution of JPH2 in human atrial was assayed by immunohistochemistry technique;mRNA expression level was measured by the qRT-PCR,and the protein expression level of JPH2 was determined using Western blot analysis.ResultsImmunohistochemistry experiments found that the expression of JPH2 protein was found in right atrial muscle tissue of SR group and AF group,SR group staining was more obvious;JPH2 mRNA levels and protein levels were significantly lower in group AF than in SR group(P<0.01).ConclusionJPH2 is widely distributed in atrial muscle cells of SR group and AF group,the expression of JPH2 in patients with CAF may be closely related to the atrial myocytes calcium disorder.

atrial fibrillation;heart atria;calcium;Junctophilin-2

国家自然科学基金资助项目(81470022)；泸州市-泸州医学院联合项目(2013LZLY-J23)。作者简介：李妙龄(1972-)，副研究员，硕士，主要从事心律失常发病机制研究。△

，E-mail:lyxjd7151@163.com。

论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.008

R541.7

A

1671-8348(2016)22-3046-03

2016-03-15

2016-04-18)