小茴香总多酚的显色条件及微波辅助提取条件的优化

陈燕芹，刘 红，，李玉华，贾贵飞，卯明江，袁希群，李 果（.贵州省应用化学特色重点实验室，贵州毕节55700；.贵州工程应用技术学院化学化工实验教学中心，贵州毕节55700）

小茴香总多酚的显色条件及微波辅助提取条件的优化

陈燕芹1，刘 红1，2，李玉华1，贾贵飞2，卯明江2，袁希群2，李 果2
（1.贵州省应用化学特色重点实验室，贵州毕节551700；2.贵州工程应用技术学院化学化工实验教学中心，贵州毕节551700）

为了探明小茴香中多酚类物质的显色条件及微波辅助提取工艺，更深入的开发利用小茴香。以小茴香为原料，通过单因素及正交实验结合，研究了小茴香总多酚的显色条件及其微波辅助提取的最佳工艺条件。实验结果表明，最佳显色条件为：取2.00 mL萃取液（1 g样品萃取后定容到100 mL），加入4.50 mL的10%碳酸钠溶液，3.00 mL、50% 的Folin-ciocalteu溶液，在室温下显色60 min。微波萃取工艺为：提取温度70℃，乙醇浓度50%，提取时间5 min，固液比1∶50（g∶mL），在此微波提取条件下总多酚的提取率为12.52 mg/g。方法研究表明浓度在0～8 μg/mL时浓度与其吸光度值有良好线性关系，其线性回归方程为y=0.0864x－0.0055，R2=0.9992，精密度实验RSD值为1.16%，回收率为97.43%± 1.57%。

小茴香，多酚，微波提取，显色条件

多酚是一种植物次生代谢产物，具有生物活性，能发挥抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、捕捉自由基、防治冠心病等功效［1-3］。因此，其提取与应用研究日益受到重视，人们试图寻找富含多酚的植物材料，以便加快开发利用多酚。建立多酚的简便和快捷的测定方法及提取方法是进一步研究和利用多酚的基础［1，3］。

小茴香又名香丝菜，为伞形科茴香属植物［4-8］，是一种具有气香、味辛的烹调香料，可用于泡菜及肉类的调制，也是一种分布广泛的中药［5］，主要成分为脂肪油、甾醇及生物碱、氨基酸、葑酮、茴香酮、茴香醛等［6-9］。近年来有关小茴香相关成分的研究已有报道，如谢建春等［7］经GC-MS确认小茴香含有茴香醛、茴香酮等；李玉华等［9］研究了同时测定小茴香中茴香醛及芦丁的方法。多酚类物质是小茴香中的重要功能成分，但对小茴香多酚的研究报道较少。

不同植物中所含酚类的种类和含量都有差异，

因此不同植物中多酚提取条件和测定的方法也有差异［1］，本文研究了Folin-Ciocalteu法测定小茴香总多酚含量的适宜条件及微波辅助法提取小茴香多酚的最佳提取条件，以期为其质量控制及以后的研究开发及应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小茴香 购自毕节佳诚超市；没食子酸、钨酸钠等试剂 均为分析纯；福林酚试剂 参考蔡文国等［1］的方法配制，使用时加入1倍蒸馏水稀释。

V5800可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；MDS-10微波消解萃取工作站 上海新仪；101A-2鼓风干燥箱 苏州伟罗自动化烘箱科技有限公司；DFY-300中药粉碎机 温岭市林大机械有限公司；SD-RO10超纯水机 北京惠源三达水处理设备有限公司；HH-4恒温水浴锅 江苏亿通电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 显色条件样品溶液及对照品溶液的制备 小茴香在105℃烘干24 h后，用粉碎机粉碎并过60目筛，置于真空干燥器中保存备用。称取干燥的小茴香样品1 g（精确到0.1 mg）于萃取罐中，加入50%的乙醇溶液40 mL，置于微波萃取仪中，在功率400 W，60℃下萃取5 min，将萃取液稍冷后抽滤，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中待用。

参照文献［1］配制200 μg/mL的没食子酸溶液。

1.2.2 福林酚法（Folin-ciocalteu）显色条件的优化

1.2.2.1 10%碳酸钠溶液加入量的影响 取洗净的50 mL容量瓶，加入1.2.1中制备的小茴香提取溶液2.00 mL（制备方法见1.2.1），分别加入不同体积的10% Na2CO3溶液（0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mL），并加入2.00 mL 50%Folinciocalteu溶液，用蒸馏水定容至50 mL，摇匀，室温放置60 min后在760 nm处测定其吸光度大小，确定碳酸钠溶液用量对反应体系的影响。

1.2.2.2 Folin-ciocalteu溶液加入量的影响 取洗净的50 mL容量瓶，加入小茴香提取溶液2.00 mL，10%碳酸钠溶液4.00 mL，再分别加入不同体积的50% Folin-ciocalteu溶液（0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00 mL），用蒸馏水定容至50 mL，摇匀，室温放置60 min后在760 nm处测定其吸光度，确定50%Folin-ciocalteu溶液加入量的最佳范围。

1.2.2.3 显色时间的影响 取洗净的50 mL容量瓶，加入小茴香提取溶液2.00 mL，10%碳酸钠溶液4.00 mL，50%Folin-ciocalteu溶液3.00 mL，用蒸馏水定容至50 mL，摇匀，室温下每间隔5 min测定一次吸光度，确定反应时间的合理范围。

1.2.2.4 显色条件的正交实验 根据单因素实验结果，以10%碳酸钠溶液添加量、50%Folin-ciocalteu溶液添加量以及显色时间为因素，以760 nm处的吸光度为考察指标，设计三因素三水平的正交实验，研究小茴香提取液的最佳显色条件。正交实验的因素及水平见表1。

1.2.3 标准曲线的绘制 采取1.2.2节优化的方法制作标准曲线。分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL没食子酸溶液置于50 mL容量瓶中，依次加入10%的碳酸钠4.50 mL，50%的Folin-ciocalteu溶液3.00 mL，再用蒸馏水定容至50 mL，室温下放置60 min，在760 nm处测定吸光度［1］。小茴香中多酚含量以没食子酸标准的含量计算，提取率（y）按式（1）进行计算。

表1 小茴香多酚显色的正交实验因素及水平Table1 The factors and levels of orthogonal design

式中，c为代入标准曲线得出的浓度，μg/mL；V1为提取后定容的体积，mL；V2为取样进行显色的体积，mL；m为样品的称量质量，g；50为显色后定容的体积。

1.2.4 微波辅助提取条件的优化

1.2.4.1 提取温度的选择 称取1 g（精确到0.1 mg）样品6份，加入40 mL、50%的乙醇溶液，分别在30、40、50、60、70、80℃下微波提取5 min，冷却抽滤，将滤液用蒸馏水定容到100 mL，取2.00 mL样品溶液按1.2.2节确定的显色条件测定其吸光度，并计算提取率。

1.2.4.2 提取时间的选择 称取1 g（精确到0.1 mg）样品5份，加入40 mL、50%的乙醇溶液，分别置于60℃下微波2、4、5、6、8 min，冷却抽滤，滤液用蒸馏水定容至100 mL，取2.00 mL按1.2.2节确定的显色条件测定其吸光度，并计算提取率。

1.2.4.3 乙醇浓度的选择 称取1 g（精确到0.1 mg）样品7份，分别加入乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液40 mL，在60℃下微波提取5 min，抽滤，将滤液用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，取2.00 mL提取液按1.2.2节确定的显色条件测定其吸光度，并计算提取率。

1.2.4.4 固液比的选择 称取1 g（精确到0.1 mg）样品6份，分别加入50%的乙醇溶液10、20、30、40、50、60、70 mL，在60℃下微波提取5 min，抽滤，将滤液用蒸馏水定容至100 mL，取2.00 mL按1.2.2节确定的显色条件测定其吸光度，并计算提取率。

1.2.4.5 提取条件的正交实验 在单因素实验的基础上，以提取温度、提取时间、乙醇浓度及固液比为因素进行四因素三水平的正交实验，研究小茴香多酚的提取条件。正交实验的因素及水平见表2。

1.2.5 方法学评价 参照文献［1］对小茴香总多酚的Folin-ciocalteu比色法进行重现性实验、精密度实验及加标回收率实验。

1.2.6 数据处理 采用Microsoft Excel 2007对单因素实验数据进行处理并作图，正交设计助手Ⅱv3.1进行正交设计及分析，n=3。

表2 提取条件的实验因素与水平Table2 The factors and levels of the extraction

2 结果与分析

2.1 显色条件对小茴香多酚测定的影响

2.1.1 10%碳酸钠溶液加入量的影响 由图1可知，显色对碳酸钠溶液的用量具有很强的依赖性，当碳酸钠溶液加入量逐渐增大时，吸光度呈明显的增大趋势，当碳酸钠溶液的加入量为4.00 mL时溶液显色较为完全，所以碳酸钠溶液的加入量为4.00 mL是反应体系最佳的显色条件。

图1 碳酸钠溶液加入量对吸光度的影响Fig.1 Effect of Na2CO3on the absorbance

2.1.2 Folin-ciocalteu溶液加入量的影响 由图2可知，反应体系的吸光度随Folin-ciocalteu溶液加入量的增大先增后降，Folin-ciocalteu溶液的加入量为3.00 mL时溶液的吸光度最大。所以确定Folin-ciocalteu溶液的最佳加入量为3.00 mL。

图2 Folin-ciocalteu溶液加入量对吸光度的影响Fig.2 Effect of Folin-ciocalteu reagent on the absorbance

2.1.3 显色时间的影响 由图3可以得到体系的吸光度随显色时间的增加逐渐增大；显色时间到50 min后，整个反应体系的吸光度的趋于平缓，这表明体系反应基本完成。为了保证显色反应完全，确定以55～65 min作为正交优化的范围。

图3 显色时间对吸光度的影响Fig.3 Effect of reaction time on the absorbance

2.1.4 显色条件的正交实验 按1.2.2.4的方法进行显色条件的优化实验，实验结果及极差分析见表3。由表3结果可以看出，时间的极差最大，所以时间对反应的影响最大，Folin-ciocalteu溶液添加量次之，碳酸钠的加入量影响最小。所以可以得到小茴香总多酚测定的最佳显色条件的是A3B2C2，即显色时间为60 min，50%Folin-ciocalteu溶液的加入量为3.00 mL，10%碳酸钠溶液的加入量为4.5 mL。按此条件进行3次平行实验，得吸光度的平均值为0.349，RSD为0.92%。

表3 小茴香总多酚显色条件的实验结果Table3 Results of orthogonal test of Foeniculum vulgare Mill

2.2 标准曲线的绘制

按1.2.3方法绘制标准曲线，得其线性回归方程为y=0.0864x-0.0055，R2=0.9992。表明没食子酸浓度为0～8 μg/mL范围内其吸光度值呈良好的线性关系，该方程可以用于小茴香多酚实验的定量测定。

2.3 微波辅助提取条件

2.3.1 提取温度的选择 由图4可知，提取温度低于70℃时，随温度升高提取率增加，这是由于多酚在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大。但是当温度大于70℃时，提取率降低，因为过高的温度可能导致多酚小部分分解［10］。故选择提取温度为50～70℃。

图4 提取温度对多酚提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total polyphenol

图5 提取时间对多酚提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of total polyphenol

2.3.2 提取时间的选择 由图5可知，提取时间小于5 min时，小茴香多酚的提取率随时间的增加而增加；提取时间大于5 min，多酚提取率降低。原因可能是随着提取时间的增加，小茴香多酚的溶出越多，但随着微波时间的继续延长，多酚吸收过量微波，热量大量聚集使多酚发生分解，导致多酚提取率降低［11］。故提取时间选择为4～6 min。

2.3.3 乙醇浓度的选择 由图6可知随着乙醇浓度的增加，提取率呈先升后降的趋势，当乙醇浓度为60%时，多酚的提取率最大。原因可能是随着乙醇浓度的提高，小茴香多酚的溶出越多，但乙醇浓度的进一步提高，小茴香中其他脂溶性成分的溶出增大，从而抑制了多酚的溶出。所以选择40%～60%为进一步优化的范围。

图6 乙醇浓度对多酚提取率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total polyphenol

2.3.4 固液比的选择 由图7可知当固液比在1∶10～1∶50（g/mL）时，多酚的提取率随着固液比的增大而提高，但是当固液比大于1∶50（g/mL）时，多酚的提取率有所降低。这可能是固液比增加时，水含量也相应增加，水与小茴香样品接触的机会增多，使多酚与乙醇接触的机会相应减少，导致多酚提取量减少［10］。故选择固液比为1∶40～1∶60（g/mL）。

图7 固液比对多酚提取率的影响Fig.7 Effect of liquid ratio on extraction rate of total polyphenol

2.3.5 提取条件的正交实验 按1.2.4.5的方法进行提取条件的正交实验，实验结果及极差分析见表4。

表4 小茴香总多酚微波辅助提取正交实验Table4 The orthogonal experimental results of of total polyphenol by microwave-assisted extraction

从表4结果得到，影响多酚提取率的各因素中，其主次顺序为提取时间＞固液比＞乙醇浓度＞提取温度。小茴香多酚提取的最优实验组合为B2D2C2A3，即提取温度为70℃，乙醇浓度为50%，提取时间为5 min，固液比为1∶50（g/mL）。按该组合进行6次平行实验，总多酚的提取率的平均值为12.52 mg/g，比表4中2号实验的提取率略高。

2.4 方法学评价

2.4.1 精密度实验 取同一样品平行测定6次，吸光度平均值为0.308，其RSD为1.16%表明该方法具有较高的精密度。

2.4.2 重现性实验 以方法1.2.4.5优化的提取条件提取6个样品，按1.2.2.4优化的显色条件进行测定，得小茴香提取率平均值为12.52 mg/g，RSD为1.06%，表明方法的重现性较好。

2.4.3 加标回收率实验 对已知总多酚含量的小茴香样品3份按1.2.5方法进行加标回收实验，得平均回收率为97.43%，表明该方法的准确度较高。以2.4.2中平均提取率作为真值，样品质量乘以平均提取率作为本底值。

Optimizatin of chromogenic condition and extraction by microwave assisted of total polyphenol from Foeniculum vulgare Mill

CHEN Yan-qin1，LIU Hong1，2，LI Yu-hua1，JIA Gui-fei2，MAO Ming-jiang2，YUAN Xi-qun2，LI Guo2
（1.Key Laboratory on Applied Chemistry，Bijie 551700，China；2.Experiment Teaching Center for Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University of Engineering Science，Bijie 551700，China）

The best chromogenic conditions and microwave extraction technology of total polyphenol in Foeniculum vulgare Mill were researched by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the chromogenic conditions were taking 2.00 mL extract liquor added 4.50 mL 10%sodium carbonate solution，3.00 mL 50%Folin-ciocalteu reagent，respectively，reacted sixty minutes at the room temperature.The microwave extraction technology was following，extraction temperature was 70℃，the concentration of ethanol was 50%，extraction time was 5 min，ratio of material to liquid was 1∶50（g∶mL），under this condition，the average extraction ratio was 12.52 mg/g.Method study showed that concentration had a good linear relationship with absorbance value if the concentration was in the range of 0～8 μg/mL，the linear regression equation was y=0.0864x-0.0055，the correlation coefficient was R2=0.9992，the recovery rate was 97.43%±1.57%.

Foeniculum vulgare Mill；polyphenol；microwave extraction；chromogenic conditions

TS207

B

1002-0306（2016）08-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.054

2015－10－22

陈燕芹（1976-），女，硕士，副教授，主要从事光谱分析方法的研究及应用，E-mail：chenyanqin1227@126.com。

贵州省科技厅联合基金（黔科合J字LKB［2013］05号）。