瓜菜类病原细菌耐药外排泵RND研究进展

王 真，赵廷昌，杨玉文，关 巍 ，胡 俊

（1.内蒙古农业大学 呼和浩特 010019； 2.中国农业科学院植物保护研究所·植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100193）

瓜菜细菌性病害的防治手段单一，造成了大多数病原细菌对抗生素及铜制剂产生耐药性。早在1962年美国佛罗里达州就发现了番茄疮痂病菌的田间链霉素耐药菌株[1]，之后有关植物病原细菌耐药性的报道屡见不鲜。向平安等检测了7株不同来源（中国）的辣椒疮痂病菌（Xanthomonas vesicatoria），发现4株辣椒疮痂病菌具有较高的链霉素耐受性[2]。Shenge等调查了来自坦桑尼亚番茄产区的番茄细菌性斑点病病原菌（Xanthomonas campestrispv.vesicatoria），发现所有菌株对铜制剂均有较高的耐受性[3]。

病原细菌对抗生素或铜制剂较强的适应性和耐受性，为瓜菜类致病细菌的防治带来挑战。病原细菌的耐药机制多种多样，而外排泵的发现，开启了人类认识病原细菌的新篇章。依赖于能量的外排泵最早在哺乳动物中发现[4]。1983年George和Levy首次报道了细菌的外排泵可以增强其多耐抗生素的能力[5]。之后在Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa中发现的以耐药结节分化家族（resistance-nodulation-division family，RND）为代表的多耐药外排泵[6-10]成为人们关注的焦点。RND多耐药外排泵对革兰氏阴性细菌耐药性贡献很大，生物信息学分析表明RND外排泵广泛存在于瓜菜作物病原细菌中。瓜菜作物RND外排泵不仅可以外排抗生素、抗菌素等有害物质，还可以被逆境激活，参与细菌侵染植物的整个过程[11-13]。但相关研究较少，具体机制还不明确。鉴于此，笔者综述了病原细菌RND外排泵的结构与功能、细菌/植物互作过程中外排泵的作用及抑制剂等方面的研究进展，以期为瓜菜作物病原细菌耐药性的研究提供参考。

1 RND外排泵家族的结构与功能

RND家族是一类三聚体外排泵，包含有内膜蛋白（IMP），位于周质的膜融合蛋白（MFP）和外膜蛋白（OMP）[14]。这3类蛋白贯穿于细菌的2层膜，协同完成细菌内有害物质的外排（图1）。可根据其外排底物的不同将RND外排泵家族分为两类，一类是疏水性或者两亲性的外排泵（HAE-RND）[15]；另一类是重金属外排泵（HME-RND）。HAE-RND家族包括 AcrAB、MexAB-OprM、MexEF-OprN、MdtAB和MdtEF等系统，HME-RND家族目前报道的仅有CusCFBA系统[16]。这2类外排泵广泛存在于瓜类和蔬菜病原细菌中，笔者以AcrAB和CusCFBA为代表介绍外排泵的结构与功能。

1.1 AcrAB-TolC外排系统的结构与功能

E.coli的Acr外排家族系统是RND外排泵研究的模型系统。Acr外排家族系统包括外膜通道TolC、膜内的次级转运蛋白AcrB以及位于周质连接内外膜的通道蛋白AcrA。AcrB-AcrA-TolC外排泵可转运多种结构不同的抗生素，赋予了细菌广谱的抗生素耐药性。

图1 AcrABZ-TolC外排泵模型[16]

在E.coli中，位于周质的AcrA与细胞内膜通过氨基端脂质修饰连接在一起，其结构域包括周质膜区域、β桶状区域、硫辛酰区域和α发夹区域[17]。其中α发夹区域与内膜的TolC蛋白结合，其他的区域可能与AcrB互作[18-21]。

AcrB贯穿于跨膜结构域和周质结构域[22]，包括3个非对称的晶体结构，结构具有可旋转性，可通过松散（L）、紧凑（T）、开放（O）型 3个结构的变化，实现底物的向外运输功能[23-25]（图1）。TolC外膜通道是由3个TolC单体组成的炮筒状结构[26]，这个通道连接周质穿过细胞外膜一直通向细胞表面[27]。

1.2 CusCFBA外排系统

CusCFBA外排系统是瓜类和蔬菜作物病原细菌重要的铜外排系统，在植物病原细菌铜制剂耐受性方面具有重要的作用。CusCFBA外排系统（图2）也是最具有代表性的一个HME-RND外排系统。它可以外排重金属Ag+和Cu+，同时还可能参与磷霉素、二硝基苯酚、硝基苯与乙硫异烟胺的外排[28-29]，该外排泵有助于细胞内Cu+平衡的维持[30]。

图2 CusBA复合结构[31]

CusCFBA外排系统由位于内膜的CusA，位于周质膜的CusB和位于外膜的CusC组成。这与AcrABC结构极为相似，其化学计量学分析结果表明 CusA∶CusB∶CusC 为 3∶6∶3[31-32]。

CusB系统包含4个亚结构域：3个β螺旋结构域和1个α螺旋结构域[33]。CusA包含12个跨膜α螺旋。CusB识别并结合Cu+和Ag+，之后将Cu+和Ag+传递给位于周质膜裂缝处CusA的M573、M623和M672等保守氨基酸残基（图3）。接收到重金属离子的CusA构象会迅速改变，使得这些重金属离子进入外排泵的周质区域中，或者直接通向细胞外[34]。另外，CusF与CusB相互作用，可能促进周质膜裂缝的打开；CusC自身的螺旋结构与CusB的α螺旋结构相互作用，构建了重金属离子的外排通道[33]。

图3 底物与CusA结合示意图[34]

2 RND耐药外排泵和病原细菌/作物互作的关系

如今植物基因组学和高通量测序等新技术已被广泛应用于植物病原细菌毒力、病原细菌/植物互作以及病原细菌耐药性分析，植物病原细菌Xanthomonas axonopodispv.citri，Xanthomonas campestrispv.campestris，Ralstonia solanacearum，Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000，Erwinia carotovorasubsp.atroseptica和Xanthomonas oryzaepv.oryzae等的测序工作相继完成[35-39]。测序结果显示植物病原细菌基因组中含有大量的RND外排泵相关基因。RND外排泵不仅在细菌耐药性方面具有重要作用，而且与细菌的致病性密切相关。另外，病原细菌的RND耐药外排泵还参与细菌体代谢副产物的分泌，如RND外排泵转运蛋白ToxGHI帮助Burkholderia glumaeBGR1外排毒黄素[40]。

Palumbo等最早发现Agrobacterium tumefaciens中的外排泵IfeAB运载体可以外排植物分泌的抑菌性物质异黄酮，并且在细菌定殖寄主作物过程中有着不可替代的作用[41]。在豆类作物病原细菌P.syringaepv.phaseolicola1448A、P.syringaepv.syringaeB728a和番茄病原细菌P.syringaepv.tomatoDC3000中，RND转运蛋白复合体MexAB-OprM对化合物（如抗生素、植物源抗菌素、洗涤剂和染料等）有着非常高的耐受力。该蛋白复合体还参与细菌在植物体内的繁殖过程[42]。P.syringaepv.syringae染色体基因编码的PseABC家族是其合成丁香毒素和丁香肽等毒素不可缺少的，pseC基因的缺失会减少植物毒素的合成和分泌量[43]。Vargas P等研究发现，番茄植株分泌的黄酮类物质可诱导丁香假单胞番茄致病变种P.syringaepv.tomato菌株PmeR蛋白的过表达，过表达的PmeR可抑制Mex-AB-OprM外排系统。PmeR和MexAB-OprM构成的互作系统，与菌株P.syringaepv.tomato在番茄植株上的定殖密切相关[44]。对丁香假单胞烟草致病变种P.syringaepv.tabaci鞭毛蛋白FliC的研究表明，ΔfliC较野生型菌株致病力和运动性都显著降低，但是mexEFoprN（RND外排系统编码基因）基因的表达量急剧上升。IV型菌毛（T4P）缺陷型突变体ΔpilA，其菌株富集能力及对烟草的致病力明显减弱，参与其多耐药外排泵MEX的相关基因mexABoprM的表达量明显上升[45]。可见RND外排泵不仅在逆境适应、有害物质外排等方面有重要的作用，而且在P.syringae中与细菌的侵染力也密切相关。

E.chrysanthemi具有2个AcrAB外排系统，它们不仅可以帮助细菌抵抗菊苣分泌的抗菌肽硫素，而且辅助细菌定殖菊苣叶片，引起病害[46]。有研究认为E.chrysanthemi侵染植物，导致寄主植物水杨酸等抗菌物质分泌增多，而这些有毒的抗菌物质正好激活了细菌多耐药外排泵编码基因的表达，提高了细菌的侵染成活率[47]。该菌株中tolC编码51kDa的蛋白与E.coli中TolC蛋白同源性高达70%。tolC基因缺失突变体不能外排盐酸小檗碱；突变体在寄主植物内可以存活，但生长较慢，不足以造成病害[11]。Brown等通过对青枯菌（R.solanacearum）多耐药外排泵相关基因acrA和dinF的功能研究发现缺失突变株对抗生素、植物毒素和洗涤剂的耐受性明显低于野生菌株；对番茄植株侵染力相对较弱。这一结果也证实了RND外排泵在瓜菜病原细菌中具有双重作用[48]。

梨火疫病菌（E.amylovora）主要侵染蔷薇科作物。在侵染初期，病原细菌会暴露在植物体表面，并被植物分泌的大量抗菌素包围。染料木黄酮是豆科作物或者非豆科作物分泌的异黄酮类抗菌素[49-50]，是植物抗毒素Phytoalexins和Phytoanticipins路径合成抗菌素的前体[51-52]。Burse A等发现蔷薇科分泌的异黄酮类抗菌素可诱导E.amylovora中外排泵编码基因acrAB的大量表达。acrB缺失突变株致病力降低，对于果树分泌的抗菌素变得敏感[53]。这与Al-Karablieh N等的研究结果不符。Al-Karablieh N等发现，E.amylovora基因tolC和acrB/tolC的缺失突变体对植物分泌的抗菌素及一些合成的抗菌剂较野生型敏感，而acrB缺失突变株对相关抗生素并不敏感。另外tolC和acrB/tolC缺失突变株的毒力并没有降低，TolC可能通过与AcrAB的互作来保持植物体表面毒素的平衡，以辅助E.amylovora突破植物表层保护组织[54]。在AcrB外排泵缺失的突变株中，过表达转运蛋白MdtABC和MdtUVW，可以使E.amylovora对黄酮类、梭链孢酸和新生霉素产生耐受性。MdtABC介导E.amylovora对胆盐、硝酸盐的抗性，其表达受双组份调节系统BaeSR的调节；MdtUVW介导其对克霉唑的耐受性。MdtABC和MdtUVW的缺失也会阻碍细菌对寄主植物的侵染[55]。他们还证明了外排蛋白NorM在E.amylovora侵染植株花器官时，可以与花柱上寄生的分泌抗菌素类物质的泛菌属竞争空间和营养，帮助E.amylovora完成侵染。而norM基因缺失突变株的毒力并没有降低，自然条件下致病力却下降[56]。

有关植物病原细菌铜制剂耐受性的研究较多，但是大都集中在对Cop系统的研究，有关Cus系统的研究相对较少[57-60]。Gutiérrez-Barranquero等通过对P.syringae全基因组信息的分析发现P.syringae的铜耐受性是由CopG、CusCBA和CopABCD操纵子协同作用完成的[61]。另外，刘星等验证了Acidovorax citrulliRND外排泵相关基因cusB与Acidovorax citrulli菌株的铜耐受性密切相关。cusB缺失突变株较野生型对铜制剂更加敏感，但不影响致病力[62]。

3 外排泵抑制剂的开发

外排泵抑制剂（EPIs）是一类抑制细菌外排泵功能的药物。利用它可使低浓度的抗生素起到较高的抗菌效果，同时减少细菌耐药性的发生。它还可以抑制生物膜的形成，降低病原菌的毒力。EPIs的研究与应用对于瓜菜细菌性病害的防治意义重大，但是相关研究难度较大。在实验室条件下，有效的EPIs已经有不少报道，但是目前还没有可以应用于实践的EPIs。

3.1 RND EPIs选取原则

实验应用中EPIs必须具备以下几个特点：第一，能促进细菌外排泵相关基因的表达；第二，药剂本身对细胞无损害；第三，在其发挥作用的同时不影响质子的跨膜运输；第四，不能增加非外排抗生素的活性；第五，不能影响抗生素的活性。这些限制因素使得实际筛选EPIs时困难重重。例如，对细菌能量平衡影响较大的羰基氰氯苯腙（CCCP）可作为一种抑制细菌外排泵的化合物。然而，该类化合物严重消耗了细菌膜质子动力，从而导致了细菌的死亡[63]。再如，外排泵调控基因有很多，而且调控功能多且复杂，很难通过对一种或者一类调控基因的抑制作用深入解析其抑制外排泵的分子机制，同时，在理论研究上，对于大部分调控基因的作用机制尚不明确，加大了研究难度。

3.2 研究较多的EPIs

目前研究较多的2类EPIs包括肽类EPIs和吡啶并嘧啶类EPIs，它们也是最具代表性的2类EPIs。

3.2.1 肽类EPIs PAβN（苯丙氨酸-精氨酸-氨酸萘酰胺，起初称为MC-207，110），英文全称phenylalanyl arginyl β-naphthylamide，是研究最早最有价值的一种EPI[64]，其结构如图4。Renau等通过对Pseudomonas aeruginosa中 MexAB、MexCD 和 Mex-EF基因过表达，从200 000个可增强P.aeruginosa菌株敏感性的小分子EPIs中筛选得到了该化合物[65]。PAβN作为外排泵的结合底物，与抗生素竞争结合区域[66]，提高细胞内抗生素浓度，从而达到抑制抗生素外排的作用。作为一种广谱性的EPIs，它还可以使结构不同的抗生素如氟喹诺酮类、大环内酯类、恶唑烷酮类、氯霉素和利福平等抗生素恢复生物活性，但不能恢复β内酰胺以及氨基糖苷类抗生素活性[64]。这类化合物最突出的优点在于，它很难使细菌对其产生耐药性。但是该类化合物的亲和力较差，必须当底物浓度积累到一定程度才能发挥作用[67]。此类化合物会阻碍细胞膜的功能，对细胞具有一定的毒性[68]，这限制了其应用前景。然而PAβN衍生物如MC-04，124，在细胞液中的稳定性高，且毒性很小，同时不会使外排泵的调控基因表达过高[69]。

图4 两类抗生素的分子式[64]

3.2.2 吡啶并嘧啶类 EPIs-ABI-PP（D13-9001）D13-9001（图4）是与RND外排泵作用过程研究最清楚的一类EPIs。其作用机制是D13-9001与AcrB、MexB的疏水端结合，影响AcrB/MexB的空间结构的改变，破坏底物与AcrB/MexB末端的运输通道造成外排泵功能故障，药物在细菌体内积累，进而达到抑制外排的效果[70]。D13-9001的亲水端存在于细菌外排泵的通道，可能阻碍底物与外排泵在这一区域的结合。

与肽类 EPIs-PAβN相比，吡啶并嘧啶类EPIs-ABI-PP安全低毒或无毒、水溶性好、药效突出[71]，具有较大的应用前景。它可以特异性地抑制AcrAB-TolC和MexAB-OprM外排泵，但是对MexXY-OprM外排泵没有抑制效果[72]，这也是它没能应用于实践中的主要原因。

4 展望

外排泵广泛存在于瓜类和蔬菜作物病原细菌中，在细菌抵抗外界胁迫过程中发挥着重要作用。目前有关RND外排泵结构与功能、外排抑制剂等的研究已取得很大的进展。植物病原细菌P.syringae，A.tumefaciens，Rhizobium etli和Bradyrhizobium japonicum中相关多耐药RND外排泵的研究已见报道，但相关机制并不清楚[73-75]。

RND多耐药外排泵是细胞代谢的外排结构，在细胞代谢中具有重要作用。在正常的细菌体内，RND外排泵相关基因的表达应该有特定的生理调节方式，对这一调控体系的研究有助于我们了解细菌适应环境的机制。另外，有关植物分泌物对病原细菌的吸引导致病害发生的研究甚多[76]。然而，病原细菌RND多耐药外排泵对植物分泌物的响应机制的研究，可以说还是一个未开发的领域。已经有研究证明，细菌RND外排泵直接参与细菌有毒物质的外排[77]，植物分泌的抗菌素类外排底物或许可以作为生物源药剂，通过化学合成其类似物并用于对细菌的防治。针对RND多耐药外排泵在病原细菌/植物互作中的重要作用的研究，也将给我们对细菌致病机制、入侵手段、植物防御特点等的研究提供思路。

综上所述，系统研究植物病原细菌RND多耐药外排泵对病原细菌的科学防治具有重大意义。相信随着分子生物学、生物信息学等相关领域的发展，对于外排泵的研究会更加的深入，这也将会给瓜菜细菌性病害的防治提供新的更好的措施。