温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对南方水稻黑条矮缩病毒介体获毒率的影响

刘丹凤,　李　沛,　弓少龙,　安兴奎,　刘玉娣,　侯茂林

(植物病虫害生物学国家重点实验室, 中国农业科学院植物保护研究所, 北京　100193)



温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对南方水稻黑条矮缩病毒介体获毒率的影响

刘丹凤,李沛,弓少龙,安兴奎,刘玉娣,侯茂林*

(植物病虫害生物学国家重点实验室, 中国农业科学院植物保护研究所, 北京100193)

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是由白背飞虱(Sogatella furcifera)传播的一种新病毒。为明确白背飞虱获毒的影响因子及南方水稻黑条矮缩病的流行规律,本文采用三因素试验,研究温度(22、27和32℃)、水稻生育期(三叶期、分蘖期和孕穗期)和白背飞虱若虫龄期(3龄和5龄)对白背飞虱获毒效率的影响。结果表明,白背飞虱在27℃和32℃下的获毒率显著高于22℃下的获毒率;在不同生育期水稻上,白背飞虱在分蘖期水稻上的获毒率高于三叶期和孕穗期;白背飞虱若虫龄期也显著影响获毒率,3龄若虫获毒率高于5龄若虫;但这些因素的交互作用对白背飞虱的获毒率无显著影响。

白背飞虱;SRBSDV;水稻;病毒传播;温度;介体昆虫

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是2001年被发现，2008年被命名的呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个新种[1]。该病毒病害已在越南及我国广大稻区大发生,并蔓延至东南亚、日本、韩国等地[2-4]。白背飞虱[Sogatella furcifera(Horváth)]是目前发现的唯一能够传播SRBSDV的介体[3]。传毒介体的获毒率和传毒率决定着植物病毒的传播,而介体成功获毒是病毒传播的前提。

温度影响病毒的传播是许多虫传病毒的共同特征。传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]在17～33℃下获毒率随温度升高而降低[5];传播Cabbage mosaic virus的桃蚜[Myzus persicae(Sulzer)]在16～27℃下获毒率较高,高于或低于此温度范围获毒率均降低[6];尖音库蚊(Culex pipiensLinnaeus)在18～30℃时对西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)的获毒率随温度的升高而升高[7]。温度对介体昆虫获毒率的影响,一方面是由于温度升高增强昆虫自身酶活性,从而使病毒降解[5],另一方面是温度影响病毒粒子在传毒介体内的复制增殖,使病毒在昆虫介体内的循回期发生变化,从而影响介体的获毒率[7-8]。如对马德里约柯托病毒(Mal de Río Cuarto virus,MRCV)，同一龄期的库氏德飞虱(Delphacodes kuscheliFennah)若虫获毒率随循回期的延长而升高[9]。白背飞虱以循回增殖的方式传播SRBSDV,循回期为6～14d[3],在26℃时循回期较短,温度过高过低循回期均延长[8]。

寄主植物对病毒的传播也存在影响。SRBSDV可侵染水稻、玉米及多种禾本科杂草,但以水稻的受侵染率较高[10]。不同水稻品种对SRBSDV也表现出不同的抗性[10-11]。寄主植物及其品种所含可溶性糖和和氨基酸种类不同,植物的表皮结构及维管束细胞壁等结构也存在差异[12-13],这些因素影响介体昆虫的刺探、取食等行为,进而影响植物病毒的传播。白背飞虱对SRBSDV的传毒率随水稻生育期而异,对三叶一心期稻苗的传毒率高于其他生育期[8]。但水稻生育期是否影响白背飞虱对SRBSDV的获毒率尚不清楚。

植物病毒的传播还与介体昆虫的虫态或龄期有关。白背飞虱日均取食量随发育阶段而异,成虫取食量大于若虫,若虫取食量又随龄期的增加而增大[14]。白背飞虱饲毒24h后,若虫对SRBSDV的获毒率高于成虫[3],白背飞虱成虫的获毒率随饲毒时间的延长而升高[2]。进一步的研究发现刺吸次数和刺吸持续时间对白背飞虱能否获毒存在影响,成功获毒的白背飞虱刺吸持续时间显著长于未获毒的个体[15]。黑面叶蝉[Graminella nigrifrons(Forbes)]若虫对玉米细条纹病毒(Maize fine streak virus,MFSV)的获毒率高于成虫[16],而传播番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)的西花蓟马[Frankliniella occidentalis(Pergande)]仅能在1龄时获毒[17]。白背飞虱若虫龄期对其获毒率的影响还未见报道。

本文采用多因素试验,测定温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱传播SRBSDV的获毒率的影响,以便进一步明确SRBSDV的流行规律,为田间南方水稻黑条矮缩病的防控提供指导。

1　材料与方法

1.1供试虫源和稻株

带毒稻株获取：初始带毒稻苗于2014年5月在云南芒市田间采集。采用盆栽感虫水稻品种‘台中1号’(‘TN1’)作为供试稻株。将带毒稻苗上孵化并发育至3～5龄的白背飞虱若虫转移到盆栽二叶一心期(10日龄)、不带毒的‘TN1’稻苗上置于人工气候箱中，(27±1)℃下饲养5d后除去白背飞虱,并将稻苗移栽至温室，(30±5)℃下继续培养,发育至相应生育期的带毒稻苗作为供试稻株,采用一步法RT-PCR检测稻苗带毒状况。

不带毒白背飞虱若虫获取：将温室盆栽、处于分蘖期的不带毒水稻单株转移到含有营养液的玻璃管内,每管接入室内饲养不带毒白背飞虱雌雄成虫4对,置于(27±1)℃人工气候箱内的防虫笼(80目,50×50×50cm)中饲养。待有产卵痕出现时,将白背飞虱雌虫转移至未被白背飞虱取食过的新稻苗上,每天转移1次。原稻苗继续在人工气候箱中培养,孵化的白背飞虱若虫发育到3龄和5龄时作为供试昆虫。

1.2SRBSDV检测方法

采用一步法RT-PCR检测稻苗和白背飞虱若虫是否携带SRBSDV[17-18]。按照RNAisoPlus[TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd]说明书提取RNA,采用SRBSDVS10(GenBank:EU523360)引物F(5′-CGCGTCATCTCAAACTACAG-3′)和R(5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′)[18],对所提取的RNA进行RT-PCR,琼脂糖凝胶电泳后出现682bp目的条带者视为带毒。

1.3试验设计

本试验旨在测定温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫获毒率的影响。试验设置3种温度:22、27、32℃(分别模拟春季、夏初和夏季温度);3种水稻生育期:三叶期(30日龄)、分蘖期(45日龄)、孕穗期(65日龄);2种白背飞虱若虫龄期:3龄(7日龄)、5龄(12日龄)。共组合为18种处理。

将不带毒白背飞虱若虫饥饿饲水3h[8]后,采用Parafilm(石蜡膜)小袋(4.5cm×4.5cm)将白背飞虱单头接于盆栽带毒稻苗的稻茎上,将小袋撑开以保证白背飞虱有充足的取食活动空间,随后将带虫的稻苗随机分配到不同温度的人工气候箱中,饲毒24h后,将白背飞虱若虫单头转移到同一人工气候箱中的不带毒3叶期稻苗上。将稻苗单株置于含有15mL营养液的玻璃管(d=2cm,h=15cm)中,在离水稻根部约4cm处用海绵固定稻苗,玻璃管管口以海绵封口,适时补充营养液。15d后收集各处理白背飞虱,用液氮冷冻后保存在-80℃冰箱中,用于带毒状况检测。每处理每次接虫15头,重复4次。计算每次处理的获毒率,即取食带毒稻苗的白背飞虱经过循回期后的带毒个体数占饲毒个体总数的比例。

1.4数据分析

白背飞虱获毒率数据经平方根反正弦转换后,采用FACTORIALANOVA(SAS9.2)分析温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱获毒率的影响,运用Tukey’sHSD多重比较法确定各水平间的差异显著性。

2　结果与分析

在温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期的组合试验中,白背飞虱若虫取食带SRBSDV水稻24h后的获毒率介于4.6%～48.7%。温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫的获毒率均存在显著影响(温度F=3.60,df=2,88,P=0.032 3;水稻生育期F=8.54,df=2,88,P=0.000 5;白背飞虱若虫龄期F=9.97,df=1,89,P=0.002 3),温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期之间的交互作用对白背飞虱若虫获毒率均没有显著影响(F<1.80,P>0.171 9;图1a)。

在不同温度(22、27、32℃)下,白背飞虱若虫获毒率在22℃最低(15.4%),显著低于32℃下的获毒率(P=0.0323);22与27℃、27与32℃下的获毒率之间没有显著差异(P>0.109;图1b)。在不同生育期(三叶期、分蘖期、孕穗期)水稻上,白背飞虱若虫在分蘖期稻苗上的获毒率最高(32.2%),显著高于其在三叶期和孕穗期稻苗上的获毒率(P<0.05),而在三叶期与孕穗期稻苗上的获毒率之间没有显著差异(P=0.319;图1c)。从白背飞虱若虫龄期之间来看,3龄若虫的获毒率(28.8%)高于5龄若虫(16.5%)(图1d)。

图1　温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫取食感染SRBSDV稻苗24 h后的获毒率的影响Fig.1　Virus acquisition rate by WBPH nymphs (3rd and 5th instars)from infected rice plants at different stages under varying temperatures

3　讨论

本试验中,白背飞虱在27℃和32℃下的获毒率均高于22℃。这与尖音库蚊对西尼罗河病毒的获毒情况[7]、玉米缢管蚜[Rhopalosiphum padi]对大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV)的获毒情况[20]类似,即在较高温度下获毒率高;与香蕉交脉蚜[Pentalonia nigronervosa(Coquerel)]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的获毒情况[21-22]、桃蚜对Cabbage mosaic virus的获毒情况[6]不同,这些介体昆虫的获毒率随温度升高先升高后降低。介体昆虫获毒率随温度变化呈现出不同变化规律的现象可能是由于介体昆虫适宜生存的温度范围不同,温度的变化影响昆虫的生长发育,进而影响病毒粒子在介体昆虫体内的复制增殖,使不同温度下的介体表现出不同的获毒率。白背飞虱若虫的适宜生长温度为25～30℃,高于或低于此温度范围均不利于若虫的生长[23]。白背飞虱在27℃和32℃时具有较高的获毒率,这可能是因为这些温度下病毒易于侵染白背飞虱,完成侵染循环。随着全球气候变暖的加剧,SRBSDV的传播能力或许更强,南方水稻黑条矮缩病在已发病地区的病情可能加重,其发病区域也可能向北扩展。

水稻生育期亦影响白背飞虱的获毒率。白背飞虱在带毒的分蘖期稻苗上取食24h后的获毒率显著高于三叶期和孕穗期稻苗,在孕穗期稻苗上取食的白背飞虱获毒率最低。出现这种现象可能与不同生育期稻苗的营养状况有关,也可能与稻苗中病毒粒子的含量变化有关。分蘖期稻苗能够为白背飞虱提供较好的营养条件,而孕穗期稻苗为白背飞虱提供的营养较分蘖期和三叶期稻苗差,不适于白背飞虱生长发育[24]。稻苗被SRBSDV侵染后,mRNA表达水平在第20天高于第14天,第30天有所下降,第40天上升至最高水平,第50天与第40天持平[25],这说明稻苗内的病毒量随时间而变化。取食接毒后不同时间的稻苗时,白背飞虱获得的病毒量可能不同,导致白背飞虱表现出不同的获毒率,这需要进一步经RT-qPCR测定病毒粒子滴度进行验证。

白背飞虱3龄若虫获毒率显著高于5龄若虫。传播MRCV的库氏德飞虱1龄若虫的获毒率高于3龄若虫[9],作者推测不同龄期若虫获毒能力的差异与若虫抗病毒侵染的生理状态有关,高龄若虫合成天然免疫因子的脂肪体发育较成熟,因此抗病毒侵染的能力也较强。西花蓟马只能在1龄时获毒TSWV,其他龄期均不能获毒,这种现象可能与西花蓟马不同龄期内部结构发育有关[17]。灰飞虱之所以不能成为SRBSDV的传播介体是因为病毒粒子不能穿越灰飞虱的中肠屏障完成侵染循环,而病毒粒子在白背飞虱体内能够穿越屏障到达唾液腺[26]。本研究中5龄若虫的获毒率低于3龄若虫,可能是因为5龄若虫中肠屏障与唾液腺屏障距离较3龄若虫长,不利于SRBSDV粒子成功完成侵染循环。

同时本研究还表明,温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期之间的交互作用均不影响白背飞虱的获毒率,这与香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的传播不受温度和介体发育阶段交互作用影响的结论相近[21]。这表明,田间白背飞虱传播SRBSDV虽然受到多种因素(如温度、水稻生育期、白背飞虱虫态)的共同作用,但是白背飞虱的获毒率仅随单个因素的影响而变化。

由此看来,适度高温能够提高白背飞虱的获毒率,白背飞虱在带毒分蘖期稻苗上的获毒率较高,低龄白背飞虱若虫更易于获毒,同时白背飞虱的获毒率仅随单个因素的影响而变化。

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(责任编辑：杨明丽)

Effectsoftemperature,ricegrowthstagesandnymphinstarontheacquisitionrateofSouthern rice black-streaked dwarf virusbySogatella furcifera

LiuDanfeng,LiPei,GongShaolong,AnXingkui,LiuYudi,HouMaolin

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV)isanewlydiscoveredvirustransmittedbythewhite-backedplanthopper, Sogatella furcifera (WBPH).ToelucidatetheepidemiologyofSRBSDVandthefactorsinfluencingitsacquisitionratebyWBPH,a3×3×2factorialexperimentwasconductedtoinvestigatetheeffectsoftemperature(22, 27and32℃),ricegrowthstages(three-leafstage,tilleringstageandbootingstage)anddifferentinstarnymphs(3rdand5th)onthevirusacquisitionrateofWBPH.Theresultsshowedthatthevirusacquisitionratewashigherat27℃and32℃thanthatat22℃,andhigherattilleringstagethanatothergrowthstages.The3rdinstarnymphshavehighervirusacquisitionratethanthe5thinstars.Theinteractionsbetweentemperature,ricegrowthstagesandvectorstadiumshowednosignificantinfluenceonthevirusacquisitionrate.

Sogatella furcifera;SRBSDV;rice;virusacquisition;temperature;vectorinsect

2014-12-15

2014-12-31

国家重点基础研究发展计划(2010CB951503)

E-mail:mlhou@ippcaas.cn

S435.112,S435.111

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.023