转基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟的抗性及对草甘膦的耐受性研究

王　江,　武奉慈,　刘新颖,　冯树丹*,　宋新元*

(1. 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨　150025; 2. 吉林省农业科学院, 长春　130033)



转基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟的抗性及对草甘膦的耐受性研究

王江1,武奉慈2,刘新颖1,冯树丹1*,宋新元2*

(1. 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨150025; 2. 吉林省农业科学院, 长春130033)

通过田间接虫、室内生测以及田间植株喷施草甘膦试验,在吉林省公主岭市综合评价了转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]的抗性以及对草甘膦的耐受性,为‘双抗12-5’在吉林省产业化应用提供基础科学数据。结果表明,与非转基因对照‘郑单958’相比,‘双抗12-5’全生育期对亚洲玉米螟都具有良好的抗性,达到高抗水平;取食‘双抗12-5’心叶、雄穗及花丝等组织7 d后的亚洲玉米螟幼虫存活率为4%～12%,而取食‘郑单958’各个组织的亚洲玉米螟幼虫存活率均高于96%。‘双抗12-5’在喷施推荐剂量(1 230 g/hm2)及在2倍推荐剂量(2 460 g/hm2)草甘膦情况下,4周内均生长正常,受害率为0;对照‘郑单958’植株第一周即表现出明显的药害症状,逐渐枯萎死亡,受害率达到100%。综上所述,‘双抗12-5’在吉林省表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。

转基因玉米;复合性状;亚洲玉米螟;抗虫性;除草剂耐受性

玉米是世界三大粮食作物之一,也是加工产业的主要原料,对保障农业产业结构稳定乃至粮食安全具有重要作用。亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]是危害我国玉米的主要害虫,北方春玉米区因玉米螟为害,一般年份减产10%左右,大发生年份可导致玉米损失30%以上甚至绝产[1-2]。在玉米生育期施用化学药剂防治玉米螟十分困难,并且对生态环境污染严重。农业生物技术的应用为食物短缺、环境污染等问题的解决带来希望,其中转基因玉米的研究与开发为防治病虫害提供了新的途径。研究表明,转Bt基因抗虫玉米对欧洲玉米螟[Ostrinianubilalis(Hübner)]和亚洲玉米螟[O.furnacalis(Guenée)]等鳞翅目害虫具有良好的防治效果[3-6]。我国转基因玉米研发始于20世纪80年代末期,现已创造出一批优异的转基因玉米材料,为产业化实施奠定了一定的基础[7]。

功能效率有效性是应用转基因植物的根本所在,常雪等报道了6个转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps玉米品系对亚洲玉米螟的杀虫效果,为亚洲玉米螟的有效防治提供技术储备[8]。后续,浙江大学研发团队通过传统育种方法,聚合耐除草剂性状,创制出兼抗虫基因cry1Ab/cry2Aj与耐除草剂基因G10evo-epsps的转基因玉米新品系‘双抗12-5’。其中,选用的cry1Ab与cry2Aj是目前研发多基因抗虫作物常用的基因,对亚洲玉米螟有较高的杀虫活性[9-13],同时新聚合的草甘膦靶标酶EPSPS基因G10,对草甘膦具有很高的耐受性[14]。

在转基因玉米新种质创制过程中每代均需目标性状鉴定筛选,是其商业化种植前必须完成的工作[15]。本试验在吉林省春玉米区对转基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’进行田间抗螟性鉴定和室内杀虫生测试验;同时进行了田间喷施高剂量目标除草剂(草甘膦)试验,为转基因玉米‘双抗12-5’的产业化推广提供基础安全数据。旨在培育出我国自主研制的、研发阶段最靠前的抗虫耐除草剂复合性状玉米新品系。

1　材料与方法

1.1供试玉米

转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’(为杂交种)及非转基因对照‘郑单958’,均由浙江大学提供。

1.2供试昆虫与除草剂

供试昆虫:亚洲玉米螟来自“国家转基因玉米大豆中试与产业化基地(公主岭)”室内人工饲料饲养种群,原始种群采自吉林省公主岭市。田间抗虫性鉴定选用即将孵化的“黑头卵”,室内生测试验选用初孵幼虫。

供试除草剂:41%草甘膦异丙胺盐(glyphosate isopropylamine salt)水剂,美国孟山都公司。

1.3试验地点

试验于2014年在“国家转基因玉米大豆中试与产业化基地(公主岭)”环境安全研究试验圃场完成。

1.4田间抗螟性鉴定

种植方式:参考当地玉米大田生产方式,随机区组设计,每个品种3次重复,小区面积为30 m2(5 m×6 m),行距60 cm,株距25 cm,试验小区间设2 m的过道间隔,避免害虫在不同小区之间的扩散。常规播种方式,常规栽培管理,全生育期不喷施杀虫剂。

心叶期抗螟性评价:在玉米心叶期(玉米植株6叶至8叶),玉米螟卵发育至“黑头卵”阶段,在玉米心叶中放置即将孵化黑头卵的蜡纸片2块(约60粒卵),每小区接虫45株。接虫14 d后,逐株调查接虫株中上部叶片被玉米螟危害程度,包括受害叶片上的虫孔大小、数量及分布等。食叶级别划分标准采用目前通用的国际玉米螟协作组制定的9级分级标准[16]。根据各株玉米的玉米螟食叶级别计算各小区心叶期玉米螟对叶片食叶级别的平均值,按食叶级别平均值划分玉米对玉米螟的抗性类型。

吐丝期抗螟性评价:玉米生长至吐丝期(雌穗露出花丝),在玉米花丝顶部放置即将孵化黑头卵的蜡纸片2块(约60粒卵),每小区接虫45株。接虫后于收获前逐株调查接虫玉米雌穗受害情况(包括花丝被害情况、穗尖被害情况、存活幼虫龄期、蛀孔隧道长度)、茎秆受害情况(包括单株蛀孔数、单株活虫数、单株隧道个数、单株隧道长度)。根据各株玉米的雌穗危害级别计算玉米螟对玉米雌穗危害级别的平均值,雌穗被害级别平均值=∑(危害级别×该级别植株数)/调查总株数。雌穗危害级别采用农业部953号公告-10.1-2007的9级分级标准[17]。按雌穗危害级别平均值划分各品种对亚洲玉米螟的抗性类型,划分依据采用农业部953号公告-10.1-2007的5级分级标准。

1.5室内抗螟性鉴定

在室内可控条件下对亚洲玉米螟的抗性进行严格鉴定,分别选取田间玉米心叶期的心叶、抽雄期的雄穗、吐丝期的花丝、灌浆期的雌穗穗尖、蜡熟期的籽粒。将不同组织清洗干净后分别置于12孔培养板中,每孔放适量玉米组织,单头饲养亚洲玉米螟初孵幼虫,利用10孔(饲养10头幼虫)作为一个处理,每个处理5次重复,即每个组织测试50头幼虫。置于温度28℃,RH 80%,光照周期L∥D=16 h∥8 h的人工气候箱内饲养,期间根据各组织被取食消耗情况随时添加相同来源的新组织。从接虫第2天开始每2 d调查1次幼虫存活状况,记录存活幼虫数,调查4次。

1.6除草剂耐受性鉴定

试验种植方式参考当地玉米大田生产方式,分区设计,小区面积不小于24 m2(6 m×4 m),3次重复,随机区组排列。

处理包括:转基因玉米喷施清水;转基因玉米喷施目标除草剂;非转基因对照喷施清水;非转基因对照喷施目标除草剂。

所用除草剂为41%草甘膦异丙胺盐水剂,施用剂量分别为农药登记标签的推荐剂量(1 230 g/hm2)和推荐剂量2倍量(2 460 g/hm2)。在玉米植株生长至6叶期喷施除草剂。各小区中间两行为调查行。分别在用药后1周、2周和4周调查记录成苗率、植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)。药害症状分级按GB/T19780.42执行。各小区草甘膦除草剂受害率计算公式:

其中:X为草甘膦处理受害率(%)；N为同一受害级别的植株数;S为危害级别;T为调查植株总数M为试验观测到的最高危害级别。

1.7数据统计分析处理

对亚洲玉米螟幼虫存活率的影响、食叶级别、玉米茎秆虫孔数、隧道长度和活虫数等数据采用DPS数据处理系统进行单因素方差分析,处理间采用新复极差法进行差异显著性分析。

2　结果与分析

2.1转基因玉米心叶期田间抗螟性

心叶期接虫试验结果显示,转基因玉米‘双抗12-5’只有极少数针刺状危害,食叶级别平均值为1级,抗性类型为高抗;非转基因对照‘郑单958’叶片有较多排孔和长条孔,心叶期食叶级别平均值为7级,抗性类型为感。表明转基因玉米‘双抗12-5’心叶期对亚洲玉米螟具有良好的防治作用。

2.2转基因玉米吐丝期田间抗螟性

吐丝期接虫试验中,调查接虫植株雌穗受害情况与茎秆受害情况。雌穗受害情况调查中,以花丝被害情况、雌穗穗尖被害情况、存活幼虫龄期、蛀孔隧道长度为评价参数,依据农业部953号公告-10.1-2007的9级分级标准[17],结果表明,转基因玉米‘双抗12-5’的雌穗被害级别平均值为1.0,抗性类型为高抗;其对应的非转基因对照‘郑单958’的雌穗被害级别平均值为5.7,抗性类型为感(表1)。茎秆受害情况调查中,以单株蛀孔数、单株活虫数、单株隧道个数和单株隧道长度作为评价参数,结果表明,转基因玉米‘双抗12-5’的茎秆未受亚洲玉米螟危害,而非转基因对照‘郑单958’茎秆受害严重,两者间差异显著(表2)。综合雌穗受害情况与茎秆受害情况,转基因玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟抗性显著高于对照‘郑单958’,并且达到高抗水平,在吐丝期对亚洲玉米螟具有良好的抗虫效果。

表1　吐丝期田间接虫试验玉米雌穗被害级别及抗虫性水平Table 1　Damage ratings and resistant levels of maize ear under artificial infestation with Ostrinia furnacalisat silking stage in the field

表2　吐丝期田间接虫试验玉米茎秆受害情况调查结果1)Table 2　Survey result of maize stalk under artificial infestation with Ostrinia furnacalis at silking stage in the field

1) 表中数据为平均值±标准误,同列数据后不同字母表示经SSR测验差异显著(P<0.05)。
The data in the table are mean±SE. Data in the same column followed by different letters are significantly different (P<0.05) according to SSR test.

2.3室内抗螟性鉴定

室内生测试验结果表明,亚洲玉米螟取食转基因玉米‘双抗12-5’心叶、雄穗、花丝、雌穗穗尖和籽粒1、3、5和7 d后的存活率呈明显的下降趋势;取食非转基因对照‘郑单958’相应组织的处理,亚洲玉米螟存活率变化不大。取食转基因玉米‘双抗12-5’3、5和7 d后,亚洲玉米螟的存活率均低于取食‘郑单958’,且达到显著水平。取食‘双抗12-5’不同组织第7天时,亚洲玉米螟存活率均较低,为4%～12%;而取食非转基因对照玉米‘郑单958’相应组织的亚洲玉米螟存活率都达到96%(表3)。结果表明,转基因玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟抗性显著高于对照‘郑单958’。

表3　不同组织对亚洲玉米螟幼虫的杀虫效果1)Table 3　Efficacy of different tissues against the Ostrinia furnacalis neonates

1) 表中数据为平均数±标准误,同行成对数据后不同字母表示经SSR测验差异显著(P<0.05)。
Data in the table are mean ± SE, within a line followed by different letters were significantly difference (P<0.05) according to SSR test.

2.4转基因玉米田间除草剂耐受性

在喷施推荐剂量和2倍推荐剂量草甘膦处理中,喷施1、2、4周后,‘双抗12-5’生长正常,受害率为0;

‘郑单958’显示出明显的药害症状,出现停止生长、叶片枯萎发黄等症状,受害率达到100%(图1)。

图1　喷施2倍推荐剂量草甘膦的两个玉米品种田间表现Fig.1　Field symptom of ‘Shuangkang 12-5’ and ‘Zhengdan 958’after application of glyphosate at double dose level

在喷施清水、推荐剂量草甘膦、2倍推荐剂量草甘膦的3个处理中,转基因玉米‘双抗12-5’株高基本一致,无显著差异;对应的非转基因对照‘郑单958’在喷施草甘膦与清水处理间的株高差异极显著(表4)。结果表明,非转基因对照‘郑单958’对草甘膦敏感,无耐受性,转基因玉米‘双抗12-5’对草甘膦具有明显的耐受性,并且喷施草甘膦对其植株生长发育无明显影响。

表4　转基因玉米对除草剂草甘膦的耐受性鉴定1)Table 4　Tolerance identification of the transgenic maize to glyphosate

1) 表中数据为平均数±标准误,同列数据后不同字母表示经SSR测验差异显著(P<0.05),“—”表示未进行检测。

The data in the table are mean±SE. Data in the same column followed by different letters are significantly different (P<0.05) according to SSR test. The symbol “—” indicated no data.

3　讨论

目标性状有效性是应用转基因植物的根本所在,针对抗虫转基因玉米,一般采用田间人工接虫鉴定与室内生测相结合的方法。例如美国孟山都公司研发的第1代转Bt基因玉米转化事件MON810的田间抗虫性评价结果表明,表达的Cry1Ab 蛋白对欧洲玉米螟和亚洲玉米螟具有很好的抗虫性,能高效控制玉米螟心叶期和穗期世代为害[18];王月琴等采用田间接虫与室内生测相结合的方法研究了转基因玉米‘BT799’对亚洲玉米螟的抗性,室内生测结果表明玉米‘BT799’对亚洲玉米螟具有较高的杀虫效果,田间接虫结果表明转基因玉米整个生育期对亚洲玉米螟都有较高的抗性[19],此试验结果与武奉慈等利用田间接虫法研究转基因玉米‘BT799’对亚洲玉米螟抗性的结果相一致[20]。针对耐除草剂转基因玉米,一般采用田间植株喷施目标除草剂的方法,例如Heck等将双价CP4-epsps转入玉米,通过在玉米植株三叶期和六叶期喷洒3.36 kg酸当量/hm2草甘膦的方法来筛选高抗株系,得到了可抗4倍于生产剂量草甘膦的转基因玉米[21]。针对多种复合性状转基因玉米,一般综合采用各个单一目标性状有效性的鉴定方法,例如孙越对转cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS基因复合性状玉米种质的目标性状进行鉴定,综合研究结果表明其抗虫性、抗草甘膦除草剂性和抗旱性效果都达到相应的标准,选育出具有优良复合性状并能稳定遗传的转基因玉米新种质[22]。同时,鉴于转基因玉米功能效率的发挥可能受推广地区环境的影响[23],本试验选址转基因玉米‘双抗12-5’拟推广的地区吉林省,综合利用田间人工接虫鉴定与室内生测相结合的方法研究其亚洲玉米螟抗性,利用田间喷施目标除草剂方法研究其草甘膦耐受性,研究结果表明转基因玉米‘双抗12-5’在吉林地区田间条件下,抗虫性与除草剂耐受性高效,表现出良好的功能效率,具有潜在的推广前景。

[1]王振营,鲁新,何康来,等. 我国研究亚洲玉米螟历史、现状与展望[J]. 沈阳农业大学学报,2000,31(5):402-412.

[2]鲁新,张国红,李丽娟,等. 吉林省亚洲玉米螟的发生规律[J]. 植物保护学报,2005,32(3):241-245.

[3]Armstrong C L,Parker G B,Pershing J C,et al. Field evaluation of European corn borer control in progeny of 173 transgenic corn events expressing an insecticidal protein fromBacillusthuringiensis[J]. Crop Science,1995,35(2):550-557.

[4]Archer T L,Schuster G,Patrick C,et al. Whorl and stalk damage by European and Southwestern corn borers to four events ofBacillusthuringiensistransgenic maize [J]. Crop Protection,2000,19(3):181-190.

[5]He Kanglai,Wang Zhenying,Zhou Darong,et al. Evaluation of transgenic Bt corn for resistance to the Asian corn borer (Lepidoptera: Pyralidae)[J]. Journal of Economic Entomology,2003,96(3): 935-940.

[6]He Kanglai,Wang Zhenying,Wen Liping,et al. Determination of baseline susceptibility to Cry1Ab protein for Asian corn borer (Lep.:Crambidae)[J]. Journal of Applied Entomology, 2005,129(8): 407-412

[7]李宁,何康来,崔蕾,等. 转基因抗虫玉米环境安全性及我国应用前景[J]. 植物保护,2011,37(6):18-26.

[8]常雪,王伟,沈志成,等. 转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟的抗性评价[J]. 植物保护学报,2013,40(4):339-344.

[9]Kota M,Daniell H,Varma S,et al. Overexpression of theBacillusthuringiensis(Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,1999,96(5):1840-1845.

[10]Bravo A,Soberón M.How to cope with insect resistance to Bt toxins?[J].Trends in Biotechnology,2008,26(10):573-579.

[11]Gouffon C,van Vliet A,van Rie J,et al. Binding sites forBacillusthuringiensisCry2Ae toxin on heliothine brush border membrane vesicles are not shared with Cry1A,Cry1F,or Vip3A toxin[J]. Applied and Environmental Microbiology,2011,77(10):3182-3188.

[12]林拥军,张启发. 改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因Cry2A:中国,CN1483823[P]. 2004-03-10.

[13]Tan S Y,Cayabyab B F,Alcantara E P,et al. Comparative susceptibility ofOstriniafurnacalis,OstrinianubilalisandDiatraeasaccharalis(Lepidoptera: Crambidae) toBacillusthuringiensisCry1 toxins[J]. Crop Protection,2011,30(9):1184-1189.

[14]李京. 新型转基因抗草甘膦玉米的培育及转基因玉米安全控制技术的研究[D]. 杭州:浙江大学,2013.

[15]刘亚,赵久然. 转基因玉米新种质创制若干技术环节的探讨[J]. 中国农业科技导报,2011(4):46-52.

[16]何康来,王振营,周大荣,等. 玉米抗螟性鉴定方法与评价标准[J]. 沈阳农业大学学报,2000,31(5):439-443.

[17]中华人民共和国农业部.农业部953号公告-10.1-2007：转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1部分:抗虫性[EB/OL]. http:∥www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200801/t20080110_952066.htm.

[18]Agbios. Agriculture and biotechnology strategies incorporated. Crop database,MON810. Essential Biosafety,2001.

[19]王月琴,何康来,王振营,等. BT799玉米对亚洲玉米螟抗性研究[J]. 应用昆虫学报,2014,51(3):636-642.

[20]武奉慈,刘金文,刘娜,等. 转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟的抗性评价[J]. 玉米科学,2014,22(6):148-150.

[21]Heck G,Armstrong C L,Astwood J D, et al. Development and characterization of aCP4EPSPS-based,glyphosate-tolerant corn event [J]. Crop Science,2005,45(1):329-339.

[22]孙越,刘秀霞,李丽莉,等. 兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定[J]. 中国农业科学,2015,48(2):215-228.

[23]宋新元,张欣芳,于壮,等. 转基因植物环境安全评价策略[J]. 生物安全学报,2011,20(1):37-42.

(责任编辑：杨明丽)

Evaluation of transgenic maize‘Shuangkang 12-5’with complex traits of insect-resistance and glyphosate-resistance for the resistance toOstriniafurnacalisand tolerance to glyphosate

Wang Jiang1,Wu Fengci2,Liu Xinying1,Feng Shudan1,Song Xinyuan2

(1. College of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin150025, China;2. Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun130033, China)

‘Shuangkang 12-5’ is a maize variety harbored the genescry1Ab/cry2AjandG10evo-epsps. Evaluation of the transgenic maize for the resistance to Asian corn borer [Ostriniafurnacalis(Guenée)] and tolerance to glyphosate was assayed in Gongzhuling City, Jilin Province. Field and indoor bioassay demonstrated that the ‘Shuangkang 12-5’ exhibited a high resistance to Asian corn borer during the whole growth period, compared with non-transgenic variety ‘Zhengdan 958’. The survival rate of the larvae that fed on different tissues of ‘Shuangkang 12-5’ for 7 days were 4%-12%, while that fed on non-transgenic lines were above 96%. When treated with glyphosate at the recommended dose (1 230 g/hm2)and the double dose (2 460 g/hm2), all the transgenic lines survived in four weeks, but there was symptom of serious chemical damage in one week and the plant gradually died for the non-transgenic lines. Thus, the transgenic maize ‘Shuangkang 12-5’presented good insect resistance and herbicide tolerance in Jilin Province.

transgenic maize;complex traits;Ostriniafurnacalis;insect resistance;herbicide tolerance

2015-08-13

2015-10-15

国家自然科学基金(31301329)；转基因生物新品种培育科技重大专项(2016ZX08011-003)；黑龙江省自然科学基金(c201307)

冯树丹E-mail:sdf6616@163.com；宋新元E-mail：songxinyuan1980@163.com

S 435.13

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.008