外源过氧化氢酶对液态发酵红茶色素的影响

钟艳梅,郑清梅,曾宪录,邓妙玲

(嘉应学院,广东梅州 514015)



外源过氧化氢酶对液态发酵红茶色素的影响

钟艳梅,郑清梅,曾宪录,邓妙玲

(嘉应学院,广东梅州 514015)

为得到优质速溶红茶,本研究以低档绿茶为原料,对其水提液添加外源过氧化氢酶(CAT)进行液态发酵酶促转化成红茶茶汤,探讨液态发酵工艺对红茶色素生成量的影响,结果表明:参照优质红茶色素含量标准,CAT酶促转化的最优条件为:加酶量0.25 U/mL,反应温度45 ℃,反应时间2 h,pH6。CAT与多酚氧化酶(PPO)存在双酶协同作用,绿茶水提液先用PPO处理后(酶添加量 0.05 U/mL,温度40 ℃,pH5,时间1.5 h)再用CAT处理,合成红茶色素的效果比单一酶源好。

速溶红茶,过氧化氢酶,多酚氧化酶,液态发酵

多酚氧化酶(PolypHenol oxidase,PPO)和过氧化物酶(Hydrogen Peroxidase,POD)是自然界中广泛存在的两种氧化还原酶类,更是茶中重要酶类,在茶树生理代谢或茶叶加工中对多酚类物质的氧化变化、茶叶品质的形成起着决定性的作用。现代制茶发酵理论认为,红茶发酵的实质就是其中的酚类在PPO及POD这两种主要酶的作用下,发生一系列的酶促氧化聚合、缩合以及一些由于湿热作用而引起的非酶促氧化反应,从而生成红茶特有的色、香、味[1]。

速溶红茶因保持了茶叶原来的色、香、味,且同时具备营养、卫生、方便等特点而深受消费者喜爱,已成为全球最受欢迎的饮品[2]。目前速溶红茶多用成品红茶作原料,也有用绿茶或其它茶作原料的,但需将茶提取液添加外源酶进行液态发酵酶促转化,如日本利用低档绿茶或陈绿茶加入外源PPO进行发酵处理,可使绿茶转变为红茶[3]。严鸿德[4]报道指出:鲜叶制成绿茶后,用沸水浸提得抽提液,加入茶树新梢第二轮中提出的PPO,可制得速溶红茶,成品有较好的香气、滋味。POD在茶中的作用类似PPO,这种酶可从茶鲜叶中提取,与茶黄烷醇接触后仍能保持它的活性[5]。有报道指出[6],茶叶内源POD可促进绿茶的转化,用于绿茶直接制造速溶红茶。添加H2O2在“发酵”过程中起氧化剂的作用,而茶叶POD则对茶黄烷醇的氧化起主要的催化作用[7]。叶庆余[8]则通过实验证明在红茶发酵过程中,PPO和 POD能催化儿茶素迅速氧化聚合成茶黄素(TFs)、茶红素(TRs)和高聚类物质(如茶褐素TBs)。PPO催化能促使生成茶黄素和相对简单的二聚体物质,而POD的催化底物较PPO广泛,可催化茶黄素氧化形成不溶性的茶红素复合物。由此认为,发酵后期茶黄素形成速度低于分解速度,而茶红素及更高聚的不溶物质积累增快,可能与POD作用有关[9-10]。

有关研究表明,茶黄素是汤色“亮”的重要成分,茶红素是汤色“红”和滋味强度的主要物质,并与茶汤的浓度有关;茶褐素是汤色“暗”的主要原因。当茶褐素含量达6%～8%时,汤色呈现红褐明亮的品质特征,而茶褐素含量低于5%时,汤色则呈现红橙明亮的特征,这在工艺上被认为发酵不足。只有在茶红素与茶黄素含量都较高且比例适当时,才能形成红茶优良的品质[11-12]。

本研究以梅州当地的低档绿茶为原料,添加POD中的过氧化氢酶(CAT)进行酶促液态发酵,将低档绿茶加工为速溶红茶,同时研究了CAT与PPO的双酶协同作用,为茶叶深加工提供一定理论基础和技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

低档绿茶梅州清凉山绿茶加工过程中的茶叶碎,含部分茶梗。

T6可见分光光度计上海沪粤明科学仪器有限公司;FB224电子分析天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司;HH.SY11-N14数显恒温水浴锅常州华冠仪器厂;L420台式低速离心机济南博华仪器设备有限公司;过氧化氢酶(CAT、50000 U/g)广东盛生物科技有限公司;多酚氧化酶(PPO、100000 U/g、含量60%)河南万达食品添加剂。

1.2液态发酵红茶汤制备

1.2.1绿茶水提液制备将低档绿茶粉碎过40目筛,茶水比1∶20(g/mL),超声波辅助浸提20～30 min,浸提温度60 ℃,冷却后以3500 r/min 离心15 min得到绿茶水提液,用于液态酶促发酵。

1.2.2液态酶促转化

1.2.2.1单因素实验酶转化温度：将绿茶水提液按0.15 U/mL的量添加外源CAT,设置不同温度分别为15、25、35、45、55和65 ℃,在pH6条件下发酵2 h,转化完成后将红茶汤迅速冷却至室温并抽滤,进行茶黄素、茶红素和茶褐素测定,以红茶色素含量为指标筛选最佳转化温度。

酶转化pH：酶源添加量同上,将绿茶水提液在35 ℃下发酵2 h,用柠檬酸-磷酸氢二钠调节pH分别为3、4、5、6、7、8,所得茶汤同上处理,选出最佳转化pH。

酶添加量：将绿茶水提液分别按0.03、0.09、0.15、0.3、0.45、0.6 U/mL的量添加外源CAT酶,在35 ℃、pH7条件下发酵2 h,所得茶汤同上处理,筛选最佳用酶量。

酶反应时间：将绿茶水提液按0.3 U/mL的量添加外源CAT,在35 ℃、pH7下发酵,设置不同反应时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 和3 h,所得茶汤同上处理,确定最佳反应时间。

1.2.2.2正交优化实验在单因素实验基础上,选择反应体系4个主要因素(温度、pH、酶添加量、时间),采用L16(44)正交设计表进行4因素4水平的正交实验,以确定CAT最佳反应条件,正交因素水平如表1。

表1　正交实验设计Table 1　Orthogonal experimental design

1.2.2.3PPO和CAT双酶转化研究采用PPO、CAT双酶源协同催化绿茶水提液,即先向反应体系中加入PPO(先前实验获得的最佳反应条件为:酶添加量0.05 U/mL,温度40 ℃,pH5,时间1.5 h),然后用CAT处理,最后沸水浴30 s终止反应,检测红茶色素含量。

1.3分析方法

茶黄素、茶红素、茶褐素检测方法,采用比色系统分析法[13]。

1.4数据处理

所有的数据采用Excel2003和SPSS17软件进行分析,采用Duncan(p<0.05)法进行多重比较,同一红茶色素之间没有共同字母的表示有显著差异。

2　结果与分析

2.1酶促转化单因素实验结果

2.1.1最佳反应温度对绿茶水提液添加CAT进行液态酶促发酵,考察不同反应温度对红茶色素生成的影响,实验结果如图1。

图1　不同温度对红茶色素形成的影响Fig.1　The effect of different temperature on the synthetic tea pigment by using CAT

由图1可知,CAT活力受温度影响,不同温度下,CAT催化形成红茶色素的情况:35 ℃时与红茶品质正相关的茶黄素含量(1.23%)和茶红素含量(7.08%)显著高于其它温度,而与红茶品质呈负相关茶褐素含量(7.85%)显著低于其它温度,参考优质红茶中红茶色素含量及比例(茶黄素一般为0.3%～1.5%、茶红素一般为5%～11%、茶褐素一般为4%～9%,茶黄素与茶红素之比1∶10～12)[13-14],此时各红茶色素含量虽然符合要求,但茶黄素与茶红素之比约为1∶6,不符合标准,而45 ℃时茶黄素含量(0.72%)、茶红素含量(6.45%)及其比例(约为1∶9)以及茶褐素含量(7.59%)都比较符合标准,综合考虑取35～45 ℃为较佳反应温度范围。

2.1.2最佳反应pH不同反应pH对速溶红茶色素生成的影响,结果如图2。

图2　pH对红茶色素形成的影响Fig.2　The effect of pH value on the synthetic tea pigment by using CAT

pH对儿茶素氧化产物形成的影响,首先是通过酶活力的作用,酶活力受环境pH的影响极大,过高或过低的pH会改变酶的性质,降低酶活力,从而使红茶色素的形成量减少[15],由图2可知不同pH条件下,CAT催化形成红茶色素的情况。从实验结果来看,当pH为7时,茶黄素生成量(0.89%)和茶红素生成量(11.45%)均显著高于其它pH的,茶黄素与茶红素比为1∶12.9,此时茶褐素生成量为7.19%,各红茶色素比较符合优质红茶标准。而当pH为6时,虽然三种红茶色素分别符合优质红茶标准,但茶黄素与茶红素比约为1∶18,茶红素比例太高会使茶汤深暗,对红茶品质不利,故最佳反应pH选择7。

2.1.3最佳酶添加量不同酶添加量对速溶红茶色素生成的影响,结果如图3。

图3　酶添加量对红茶色素合成的影响Fig.3　The effect of enzyme concentration on the synthetic tea pigment by using CAT

由图3可知,不同酶添加量条件下,CAT催化形成红茶色素的情况:茶黄素生成量较高的酶添加量是0.3 U/mL(0.63%),显著高于其它酶添加量;茶红素生成量较高的酶添加量是0.3 U/mL(8.02%),此时两者比例约为1∶12;在此酶添加量下,茶褐素生成量为8.81%,符合优质红茶标准,故最佳酶添加量选0.3 U/mL。

2.1.4最佳反应时间不同反应时间对速溶红茶色素生成的影响,结果如图4。

图4　反应时间对红茶色素合成的影响Fig.4　The effect of reaction time on the synthetic tea pigment by using CAT

由图4可知,不同反应时间下各色素含量变化:当反应时间为2.5 h时,茶黄素生成量(0.85%)和茶红素生成量(6.33%)显著高于其它反应时间(两者比例1∶7.4)此时茶褐素生成量为8.79%,相比其它组比较符合优质红茶色素含量标准,故最佳反应时间取2.5 h。

2.2反应条件的正交优化

表2、表4、表6分别为茶黄素、茶红素和茶褐素正交实验结果,表3、表5、表7为正交实验的方差分析表。

表2　茶黄素正交实验结果Table 2　The result of orthogonal experiment of TFs

CAT催化转化茶黄素时,根据表2极差分析结果,各因素对茶黄素含量的影响顺序为B>D>C>A;根据表3正交实验方差分析结果,B因子具有显著性(p<0.05)其他因素对实验结果的影响不明显;最优组合为A2B2C1D4。

表3　茶黄素正交实验的方差分析表Table 3　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TFs

CAT催化转化茶红素时,根据表4极差分析结果,各因素对茶红素含量的影响顺序为D>B>C>A;根据表5正交实验方差分析结果,D因子具有显著性(p<0.05);最优组合为A4B3C4D1。

表4　茶红素正交实验结果Table 4　The result of orthogonal experiment of TRs

CAT催化转化茶褐素时,据表6极差分析结果,各因素对茶褐素含量的影响顺序为D>B>C>A;据表7正交实验方差分析结果,各因子显著性都不高;优组合为A3B2C2D2。

表5　茶红素正交实验的方差分析表Table 5　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TRs

表6　茶褐素正交实验结果Table 6　The result of orthogonal experiment of TBs

表7　茶褐素正交实验的方差分析表Table 7　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TBs

正交实验后的茶黄素、茶红素、茶褐素含量实验结果经过方差分析,单独分析出的优化条件不一致,则根据因素的影响主次等综合考虑,确定最佳工艺条件。

对于因素A(反应时间),其对茶黄素、茶红素和茶褐素影响均为次要因素,比较之下A1的红茶品质较好,因此取A1(2 h);因素B(pH)对茶黄素影响排第一位,故取B2,其对茶红素影响排第二位,取B3,而对茶褐素影响也排第二位,取B2,因此因素B取B2(6);因素C对茶红素、茶黄素和茶褐素的影响都排第三位,分别取C1C4C2,三者相比取C4红茶品质较好,故因素C取C4(45 ℃);对于因素D,其对茶红素的影响排第一位,此时取D1,其对茶黄素和茶褐素的影响排第二位,为较次要因素,故因素D取D1(0.25 U/mL)。综合分析,最优组合为A1B2C4D1,即加酶量为0.25 U/mL,反应温度为45 ℃,pH6,反应时间2 h。

2.3双酶催化转化结果

结果如表8。

表8　单一酶源与双酶源对合成红茶色素的比较Table 8　The comparison between single enzyme and double enzyme on synthetic tea pigment

酶促氧化制备红茶所采用的酶类主要是PPO和POD[16],其中PPO主要催化儿茶素生成茶黄素及相对简单的二聚体,而POD不仅催化儿茶素生成茶黄素和二聚体,且能催化茶黄素生成茶红素以及更复杂的高聚体TBs等,因此,在双酶体系下酶促氧化可以进行得更彻底。由表8可知,单一酶源酶促转化时,茶黄素和茶红素的比例过小或过大;双酶酶促转化红茶色素结果显示:茶黄素含量略微超出标准,但茶黄素与茶红素的比例适当,而茶褐素的生成量减少,使红茶茶汤有较好的品质。

3　结论与讨论

在红茶液态发酵中,利用外源CAT可将绿茶水提液酶促转化成红茶茶汤,在一定条件下,其对红茶色素的生成量有显著影响,酶反应最优条件为:加酶量0.25 U/mL,反应温度45 ℃,反应时间2 h,pH6。CAT与PPO存在双酶协同作用,绿茶水提液先用PPO处理后(酶添加量0.05 U/mL,温度40 ℃,pH5,时间1.5 h)再用CAT处理,生成红茶色素的效果比单一酶源要好。

本实验不但探究出外源CAT催化转化红茶色素的最佳条件,还首次采用双酶作用于速溶红茶液态发酵,与单一酶源转化法相比,该方法可使茶黄素的生成量提高而使茶褐素的生成量减少,使得红茶茶汤有较好的品质。先加入POD的作用主要是形成茶黄素,而酯型茶黄素(TFG和TFDG)中,TFG能被水解产生没食子酸,且能导致苯丙卓酚酮环核的裂解作用而形成3,4-二羟苯甲酸、没食子酸、咖啡酸和邻苯二酚等一系列的裂解产物。Robertson研究认为[20],酯型茶黄素(TFG和TFDG)被水解产生没食子酸的过程与CAT无关。随后加入的CAT可使TFG酶促氧化转化为茶红素,因此在双酶体系下该酶促反应可以进行得更为彻底。

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Effect of exogenous catalase on the pigment composition of fermented instant black tea

ZHONG Yan-mei,ZHENG Qing-mei,ZENG Xian-lu,DENG Miao-ling

(School of Life Science,Jiaying University,Meizhou 514015,China)

Exogenous catalase was added in water extract solution of low-grade green tea to transform it into instant black tea by liquid state fermentation,the effects of enzyme types and addition rates on the pigment composition of black tea infusion were investigated;and fermentation technology was optimized by reference to standard of top quality black tea. Result showed that the optimized conditions were:catalase addition rate was 0.25 U/mL,fermentation temperature at 45 ℃,pH6,for 2 h. Pretreatment of the green tea extract with polyphenol oxidase(addition rate 0.05 U/mL,temperature 40 ℃,pH5,time 1.5 h)previous to the addition of catalase produced better pigment composition of black tea than addition of catalase along,indicating that synergetic action existed between the two enzymes.

instant tea;catalase;polyphenol oxidase;liquid-state fermentation

2015-04-23

钟艳梅(1975-),女,硕士,讲师,研究方向:食品资源研究开发,E-mail:zym@jyu.edu.cn。

郑清梅(1979-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物化学,E-mail:zhqm78@163.com。

广东省自然科学基金(S2013010013693)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.045