桔梗糖蛋白超临界辅助提取工艺及对α葡萄糖苷酶抑制作用的研究

赵胜男,郑晓凤,崔　琳,廉亚楠,林雪燕,果婷婷,谷　娜,高金波

(佳木斯大学 药学院,黑龙江佳木斯 154007)



赵胜男,郑晓凤,崔琳,廉亚楠,林雪燕,果婷婷,谷娜,高金波*

(佳木斯大学 药学院,黑龙江佳木斯 154007)

确定超临界CO2萃取辅助超声波提取桔梗糖蛋白的最佳工艺与其对α-葡萄糖苷酶抑制作用。以乙醇为夹带剂,采用超临界CO2萃取技术辅助超声提取桔梗中的糖蛋白,以得率及其多糖含量为检测指标,对提取工艺进行评价;以PNPG为底物测定对α-葡萄糖苷酶抑制作用。结果表明:超临界CO2萃取的最佳工艺为:温度45 ℃,压力25 MPa,乙醇浓度为70%,萃取时间为1.5 h;其平均得率和糖含量分别为27.83%和62.68%,糖蛋白和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度IC50值分别为0.276 mg/mL和0.321 mg/mL。结果表明:超临界CO2萃取技术结合超声提取桔梗糖蛋白的方法可行,步骤简单,无污染,桔梗糖蛋白对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用。

超临界,桔梗,糖蛋白,提取工艺,α-葡萄糖苷酶抑制

桔梗为桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC)植物干燥根,别名为白药、利如、梗草、铃铛花、大药等[1],性平,味苦、辛,有祛痰与镇咳、降血糖、抗溃疡、抗炎等作用[2-3]。桔梗中的化学成分包括桔梗皂苷、桔梗多糖、桔梗酸、远志酸等[4]。糖蛋白是一种复合糖,是由比较短、往往带分支的寡糖与多肽链共价连接而成的一类结合蛋白质,其广泛分布于植物、动物体内[5]。并且具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、防衰老、调节免疫、降血糖、降血脂等功效[6-7]。超临界CO2萃取技术是一种高效、无污染的提取方法,它能脱去植物中的脂溶性成分,使细胞壁脆化[8-9],并且CO2是一种典型的环保型的溶剂,有较强的溶解性和扩散性[10-12]。本文采用超临界CO2萃取技术辅助超声法提取桔梗植物中的糖蛋白,并对α-葡萄糖苷酶的抑制作用进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

桔梗购于佳木斯药店,安国市振宇中药材饮片有限公司 生产批号:2013814;CO2气食品级哈尔滨黎明气体有限公司;DEAE-52上海源叶生物科技有限公司;Sephadex G -75上海金穗生物科技有限公司。

无水乙醇、碳酸氢钠、苯酚天津市凯通化学试剂有限公司;浓硫酸北京化工厂;葡萄糖天津市恒兴化学试剂制造有限公司,均为分析纯。

HA221-50-06型超临界CO2萃取仪华安超临界萃取有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;LG10-2.4A型高速离心机北京京立离心机有限公司;DZF-6050型真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司;UV757CRT紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司;RE-52系列旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1提取工艺流程桔梗→50 ℃烘干→粉碎→过筛→超临界CO2萃取→取粉末适量→蒸馏水超声→浓缩→离心→醇沉→离心→烘干→称量。

1.2.2桔梗脱脂采用超临界CO2萃取法进行脱脂[13]。称取粉碎过筛的桔梗125 g,加入不同浓度的乙醇溶液80 mL,浸泡12 h,将其装入1 L萃取釜中。在设定萃取温度、压力下萃取一定时间,取出晾干,备用。

1.2.3桔梗糖蛋白的提取采用超声波法提取桔梗糖蛋白。准确称量桔梗粉末25 g,按料液比1∶46(w/m)加入蒸馏水,搅拌静置40 min,在75 ℃、400 W的功率下超声40 min,过滤,7000 r/min离心10 min,上清液浓缩约100 mL,醇沉过夜(终浓度为80%以上),离心,沉淀物用水复溶,离心,去除沉淀,再醇沉过夜,离心,即得桔梗糖蛋白,烘干后称量,计算得率,公式如下。

式中:w为提取糖蛋白的质量，W为称取桔梗粉末的质量。

1.2.4多糖的含量测定采用苯酚硫酸法测定桔梗糖蛋白中多糖的含量[14]。精密称取桔梗糖蛋白10 mg,用蒸馏水溶解至25 mL。取100 μL于10 mL具塞试管中,加蒸馏水至2 mL,再分别向各试管中加入5%的苯酚溶液1.00 mL,摇匀,加入浓硫酸5.00 mL,室温静置5 min,置于80 ℃下水浴20 min,冷却,于490 nm处测其吸光度,重复测定3次。根据标准曲线方程计算糖蛋白中糖含量(以葡萄糖计)。

糖含量(%)=计算所得葡萄糖的浓度×稀释倍数/样品的质量×100

1.2.5单因素实验超临界萃取温度考察:恒定压力为30 MPa,乙醇浓度为70%,时间为1.5 h,在温度分别为35、40、45、50、55 ℃时,先进行超临界CO2辅助提取,再按超声波操作条件进行提取,称取糖蛋白的质量,测定糖含量。

超临界萃取压力考察:恒定温度为50 ℃,乙醇浓度为70%,时间为1.5 h,在压力分别为15、20、25、30、35 MPa时,进行糖蛋白提取,方法同上。

夹带剂乙醇浓度考察:恒定超临界萃取温度为50 ℃,萃取时间为1.5 h,萃取压力为25 MPa,在乙醇浓度分别为0%、30%、50%、70%、90%时,进行糖蛋白提取,方法同上。

萃取时间考察:恒定温度为50 ℃,压力为25 MPa,乙醇浓度为70%,在萃取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h时,进行糖蛋白提取,方法同上。

1.2.6超临界CO2辅助提取正交设计在单因素实验的基础上,以萃取压力、萃取温度、乙醇浓度和萃取时间,设计L9(34)因素水平见表1。

表1　L9(34)正交实验因素水平表Table 1　L9(34)Factors and levels in orthogonal array design

1.2.7超临界CO2萃取工艺的优化采用权重系数法优化超临界CO2萃取工艺。将试样1～9号实验中测得的得率和多糖含量列入正交设计表中,采用综合评分法,分别将得率和多糖含量最高的积分设定为10分,与之对比依次对9个样品进行评分。根据实验目的将得率的权重系数设定为0.6,而将多糖的含量设定为0.4进行加权评分;综合评分的计算公式为:Y=0.6Y1+0.4Y2。

1.2.8α-葡萄糖苷酶的抑制作用α-葡萄糖苷酶的活力测定:以PNPG为底物,反应系统为:67 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)2.0 mL,1 mg/mL谷胱甘肽溶液50 μL,10 mg/mLα-葡萄糖苷酶溶液50 μL,37 ℃保温20 min后,加入0.116 mol/L PNPG溶液50 μL,反应10 min,用0.1 mol/L Na2CO3溶液10 mL终止反应,于波长400 nm处测定在酶作用下释放出的对硝基酚(PNP)的吸收值[15]。其中酶活力单位定义[16]:在37 ℃,pH6.8,1 min内水解PNPG释放1 μmol PNP所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

α-葡萄糖苷酶抑制率的测定:分别取浓度为10 mg/mL的桔梗糖蛋白溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0 mL于10 mL量瓶中,定容,摇匀[17]。分别吸取各溶液1.00 mL加入到67 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)2.0 mL和10 mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50 μL的溶液中,在放入37 ℃恒温水浴锅中20 min后取出,加入0.116 mol/L PNPG溶液50 μL,反应10 min,用0.1 mol/L Na2CO3溶液10 mL终止反应。在波长400 nm处测量吸光度值。同时设不加酶的样品空白组,不加样品的无样品组,不加样品和酶的无样空白组和阳性对照组(阿卡波糖),按下式计算抑制率。

2　结果与分析

2.1葡萄糖的标准曲线

精密称取100 mg恒重的葡萄糖标准品,定容至100 mL量瓶中。精密吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL定容至10 mL,按样品测定方法取100 μL进行操作测其吸光度,以葡萄糖的浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线,其方程为y=3.485x+0.3586;相关系数r=0.9993。

2.2单因素的实验结果

2.2.1萃取温度的影响从图1可知,得率随着萃取温度的增加而不断增大,这是因为温度增加,脂溶性成分在超临界流体CO2中的溶解度增加,桔梗细胞壁的脆性增加,有利于细胞中糖蛋白物质的释放。糖含量一开始出现降低,而后也随温度的增加而增大,50 ℃时得率和糖含量均达到最大值。

图1　温度对得率的影响Fig.1　Effect of temperature on the yield

2.2.2萃取压力的影响由图2可得,得率随着萃取压力的增加开始增大,25 MPa时达最大,随后出现下降趋势。这是因为压力的增加虽有利于桔梗中脂溶性成分进入流体之中,细胞变脆[18];随后由于细胞破壁性增大,糖蛋白流失随之增大,糖含量随着萃取压力的增加一直呈下降趋势。

图2　压力对得率的影响Fig.2　Effect of pressure on the yield

2.2.3乙醇浓度的影响乙醇为夹带剂,以增强对桔梗中脂溶性物质和有色物质的去除作用,实验结果如图3所示。随着乙醇浓度的增加,得率不断的增大但不显著,当乙醇浓度达到70%时得率达到最大;糖含量随乙醇浓度的增加开始下降,50%时最低,70%时达到最大。这是因为在超临界状态下,乙醇溶解脂类物质的能力随乙醇的浓度增加而增大,当乙醇的浓度达到一定程度后,细胞破裂糖蛋白流失增加。

图3　乙醇浓度对得率的影响Fig.3　Effect of ethanol concentration on the yield

2.2.4萃取时间的影响不同萃取时间对得率及糖含量的影响如图4所示。得率随着萃取时间的增加不断的增大,当1.5 h时达到最大值,随后开始降低,糖含量1 h时最低,1.5～2.0 h时较高。这可能是因为萃取时间与植物细胞壁的厚度及脆性有关所致。

图4　时间对得率的影响Fig.4　Effect of time on the yield

2.3正交实验与方差分析

正交实验数据结果见表2。方差分析见表3。

表3　方差分析表Table 3　Table of variance analysis

注:F0.05(2,2)=19.000。

表2　L9(34)正交实验结果Table 2　Results of L9(34)orthogonal experiment

根据表2中极差R值可知:影响因素的大小顺序为D>A>B>C,即影响桔梗糖蛋白得率的诸因素的主次关系依次是萃取时间(h)>萃取温度(℃)>萃取压力(MPa)>乙醇浓度(%)。根据方差分析中F值可知:因素D具有显著性差异,为提取工艺的主要影响因素。最终确定超临界CO2的最佳萃取工艺条件为A1B2C2D2,即萃取时间1.5 h,萃取温度45 ℃,萃取压力25 MPa,乙醇浓度为70%。

2.4工艺验证实验

在正交实验所得到的最佳工艺条件下,平行5次验证实验。结果为糖蛋白的得率平均值为27.83%,糖含量的平均值为62.68%。RSD为5.11%。单纯用超声波提取法进行提取,结果为糖蛋白的得率平均值为12.43%,糖含量的平均值为61.28%。RSD为4.50%。结果表明,本法比单纯超声波法的得率高1.24倍,糖含量两者基本相当。

2.5不同浓度抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性的影响

桔梗糖蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图5。从图可以看出,随着浓度的增加,抑制率增大,且与阿卡波糖的抑制能力与抑制趋势相近,说明桔梗糖蛋白的抑制作用较强,糖蛋白和阿卡波糖半数抑制浓度IC50值分别为0.276 mg/mL和0.321 mg/mL。

图5　桔梗糖蛋白对α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.5　Effect of Glycoprotein from Platycodon grandiflorum on α-glucosidase

3　结论

通过单因素考察和正交实验,结合权重系数法,最终确定出超临界CO2萃取工艺的最佳条件为:温度为45 ℃,萃取压力为25 MPa,乙醇浓度为70%,时间为1.5 h。根据对比实验结果可知,超临界CO2萃取技术辅助超声波法能提高桔梗糖蛋白的得率,且多糖的含量相对保持不变。由α-葡萄糖苷酶抑制实验结果表明,桔梗糖蛋白对其有较强的抑制作用。总之，采用超临界CO2萃取技术辅助超声波提取桔梗糖蛋白的工艺不但得率高,而且省去了有机溶剂的脱脂、脱色过程,安全、无污染,能提高桔梗的经济效益和应用价值,为今后的进一步研究奠定了基础。

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Study on the optimum conditions of the extraction and inhibition ofα-glucosidase of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwith supercritical CO2and ultrasonic

ZHAO Sheng-nan,ZHENG Xiao-feng,CUI Lin,LIAN Ya-nan,LIN Xue-yan,GUO Ting-ting,GU Na,GAO Jin-bo*

(Pharmacy college of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

To determine the optimum conditions of the extraction and explore the inhibition ofα-glucosidase of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwith supercritical CO2and ultrasonic. Ethyl alcohol was used as entrainer to extract the glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwith supercritical CO2and ultrasonic-assisted extraction. Extraction yield and the content of polysaccharide were as detection index to get the optimum conditions. When the extraction temperature was 45 ℃,extraction pressure was 25 MPa,entrainer was 70% ethyl ethanol and extraction time was 1.5 h,the average values of yield and content of the polysaccharide were 27.83% and 62.68%. The median inhibitory concentration onα-glycosidase activity of glycoprotein and Acarbose IC50were 0.276 mg/mL and 0.321 mg/mL. The results showed that supercritical CO2combined with ultrasonic extraction of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwas feasible,simple and pollution-free.Platycodonglycoproteinhad stronger inhibitory effect onα-glycosidase。

supercritical;Platycodongrandiflorum;glycoprotein;extraction process;inhibition ofα-glucosidase

2015-07-09

赵胜男(1993-)，女，本科，研究方向：天然产物药物分析，E-mail:1634217800@qq.com。

高金波(1960-)，女，本科，教授，研究方向：天然产物药物分析，E-mail:gaojinbo2001@163.com。

佳木斯大学大学生“校长创新创业基金项目”研发项目课题(xzyf2013-07);佳木斯大学大学研究生科技创新项目(LM2015-095);佳木斯大学大学生科技创新项目(xsym2014-013)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0187-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.031