青砖茶提取物不同极性部位对三种细菌的抑制作用研究

杨清华,杨新河,傅本重,覃彩芹,黄明军,吕帮玉

(1.湖北工程学院生命科学技术学院,湖北孝感 432000;2. 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室,湖北孝感 432000;3.湖北大学生命科学学院,湖北武汉 430062;4.湖北工程学院化学与材料科学学院,湖北孝感 432000)



青砖茶提取物不同极性部位对三种细菌的抑制作用研究

杨清华1,2,3,杨新河1,2,*,傅本重1,2,覃彩芹4,黄明军1,2,3,吕帮玉1,2

(1.湖北工程学院生命科学技术学院,湖北孝感 432000;2. 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室,湖北孝感 432000;3.湖北大学生命科学学院,湖北武汉 430062;4.湖北工程学院化学与材料科学学院,湖北孝感 432000)

采用滤纸片法测定青砖茶提取物不同极性部位氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制性能,并测定它们的最小抑菌浓度和总酚含量。结果表明:乙酸乙酯层对三种菌的抑制效果最优,当其浓度为100 mg/mL时,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径依次为29.19、27.97、27.35 mm;最小抑菌浓度依次为1.56、3.12、6.25 mg/mL;总酚含量高达81.62%,提示总酚为其抑菌的主要活性成分。

青砖茶,提取物,不同极性部位,抑菌

黑茶,是中国六大茶类之一,是中国特有的一大茶类,属于后发酵茶。其生产历史悠久,主产于湖南、湖北、云南、四川、广西等地,以制成紧压茶主要销往西藏、内蒙、新疆、青海、甘肃、宁夏等边疆地区。近年来研究表明,黑茶对糖尿病、高血脂、肥胖等糖脂代谢性疾病具有良好的保健效果[1-7],逐渐成为茶叶消费的新热点,因而内销市场日渐扩大,整个黑茶产业呈现良好的发展态势。

青砖茶是黑茶的一种,主产于湖北赤壁、咸宁、通山、崇阳、通城等县及湖南临湘市,采用老青茶为主要原料,经筛分、拼配、蒸汽压制定型、干燥等特定工艺制成,具有色泽青褐、内质香气纯正无青气、滋味纯正、汤色深黄红稍亮、叶底暗褐呈猪肝色等特有品质。青砖茶储藏年份越久,风味品质越好。

近年来,关于茶叶抑菌方面的报道多局限于普通绿茶、红茶、普洱茶和乌龙茶对口腔致病菌或绿茶、普洱茶对食源性微生物和致病菌的抑制效果研究[8-14],但关于青砖茶对有害菌的抑制作用未有研究报道。另外,GB/T 9833.9-2013紧压茶中规定青砖茶含水量不超过12%[15],其长年室内仓库自然贮藏中不易出现霉变,说明青砖茶可能有较强抑菌作用。本文以青砖茶作为研究材料,采用滤纸片法测定其提取物不同极性部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌三种细菌的抑制性能,并测定它们的最小抑菌浓度和茶多酚含量,旨在探明青砖茶对上述三种菌的抑制作用及活性部位,初步探讨抑菌效果与多酚类的相关性,为深入研究明确青砖茶抑菌活性成分并揭示其抑菌机理提供基础,也为将其深度开发成天然抑菌物质提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

青砖茶赤壁市青砖茶专卖点,2014年赵李桥茶厂生产;牛肉膏蛋白胨琼脂培养基蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蒸馏水1000 mL、琼脂15～20 g、pH7.0～pH7.2,121 ℃高压蒸汽灭菌30 min,备用;液体培养基不加琼脂;大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌湖北工程学院生命科学技术学院菌种保存实验室。

SW-CJ-2G型双人净化工作台苏州净化设备有限公司;SPX-250B-Ⅲ型生化培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司;LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;QSB-100型高速多功能粉粹机永康市乐趣工贸有限公司;RE-52-99型旋转蒸发仪上海亚荣有限公司;SHZ-D(III)型循环水多用真空泵巩义市科华仪器设备有限公司;DC-1006型节能型恒温槽宁波新芝生物科技有限公司;DZKW-S-4型电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器厂;752型紫外可见光分光光度计上海舜宇恒平科学仪器有限公司;ZHWY-211B型恒温培养振荡器上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.2青砖茶提取物的制备

称取适量粉碎至60目的青砖茶样品,按照料液比1∶10(m/v)加入煮沸的蒸馏水,在沸水浴中浸提15 min,过滤,滤渣按照同样的方法浸提2次,合并3次滤液,滤液浓缩至原有体积的1/3。量取一定体积的浓缩液经冷冻干燥制备成水提取物,余下的滤液依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次,制得氯仿萃取层、乙酸乙酯萃取层、正丁醇萃取层及水层,分别浓缩冻干得到氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层部位样品,密闭保藏,备用。

1.3菌悬液的制备

首先采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基活化供试菌种,接着用液体培养基扩大培养活化的菌种12小时,然后在波长600 nm处用无菌的液体培养基调零后测定含菌培养液的吸光值,再将含菌培养液稀释至吸光值约0.200,最后进行10倍法稀释,其中大肠杆菌和枯草芽孢杆菌稀释至102,金黄色葡萄球菌稀释至103,得到菌悬液。

1.4滤纸片法测定抑菌作用

将青砖茶提取物不同极性部位冻干品用无菌水配制成100 mg/mL的溶液,把直径6 mm灭菌滤纸片分别置入各溶液中浸泡24 h,取菌悬液0.1 mL,滴入平皿中倒有固体培养基的表面,用涂布器使其均匀涂布在培养基表面,用无菌镊子夹取已浸泡的滤纸片置入含菌平皿中,每皿4片,每个菌种重复做2皿,并用无菌水浸泡的滤纸片做对照。37 ℃培养24 h后用十字交叉法测定抑菌圈直径。

1.5最小抑菌浓度测定

将青砖茶提取物不同极性部位冻干品用无菌水配制成浓度为100 mg/mL的原液,然后将各原液稀释配成浓度为75、50、37.5、25、18.75、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL溶液。测定相应部位样品对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。在无菌培养皿中分别加入1.5 mL不同极性部位各浓度溶液和15 mL熔化的培养基,混匀,待培养基凝固后,取0.1 mL菌悬液于培养基上涂布均匀,不同极性部位各浓度溶液重复2次,同时以1.5 mL无菌水替代不同极性部位溶液的培养基作为空白对照,将各培养皿放入37 ℃培养箱中恒温培养24 h后观察,以培养皿中完全无菌生长的最低浓度作为相应部位样品对相应菌的最小抑菌浓度。

1.6青砖茶中茶多酚测定

参照GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法略作改动后进行各样品中总多酚的测定[16]。取1 mL经过处理稀释后的提取物溶液,加入5 mL福林酚试剂,摇匀,反应3～8 min,加入4 mL 7.5%的碳酸钠溶液,摇匀,室温放置1 h,用比色皿在765 nm波长下用分光光度计测定吸光值。配制标准品没食子酸浓度梯度为10、20、30、40、50 μg/mL。按照上述方法测定得到吸光值,根据没食子酸浓度(X,μg/mL)和反应后的吸光值(Y)做出标准曲线为y=0.0101x+0.0295(R2=0.999),各样品中总多酚的含量以每克样品中含有相当于没食子酸的毫克数表示后换算成百分含量。

1.7数据统计与处理

青砖茶提取物不同部位对三种菌的抑菌作用以抑菌圈直径的平均数±标准差表示;组间差异用方差分析检验。

2　结果与分析

2.1滤纸片法测定青砖茶提取物不同极性部位的抑菌作用

表1　青砖茶提取物不同极性部位对实验菌的抑菌圈直径结果(mm)Table 1　Result of antimicrobial diameters on inhibiting test bacterias of different polar fractions from Qingzhuan brick tea extract(mm)

注:样品浓度均为100 mg/mL,空白对照均无抑菌圈,“-”表示无抑菌圈,同列不同大写字母表示极显著差异水平(p<0.01),小写字母表示显著差异水平(p<0.05)。

当青砖茶提取物不同极性部位的浓度为100 mg/mL时,它们对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径结果见表1所示,水提物、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有抑制作用,水提物、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层对金黄色葡萄球菌有抑制作用。其中乙酸乙酯层对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性最强,对应的抑菌圈直径为29.19、27.97,27.35 mm,与另外四种样品的抑菌圈直径比较,均达到极显著差异水平(p<0.01)。水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性位居第二,抑菌圈直径分别为18.94、18.66，18.84 mm,均明显大于正丁醇层、氯仿层和水层对三种菌的抑菌圈。从表1中还可知,正丁醇层对三种菌的抑制活性居乙酸乙酯层和水提物之后,氯仿层和水层对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用相当且较弱,氯仿层对金黄色葡萄球菌有轻微的抑制作用,而水层没有抑制作用。

2.2最小抑菌浓度的测定

由表2可知,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度从低到高依次为乙酸乙酯层1.56 mg/mL、正丁醇层 6.25 mg/mL、水提物18.75 mg/mL和氯仿层75 mg/mL,而水层对金黄色葡萄球菌没有抑制作用,不能求得最小抑菌浓度;对大肠杆菌的最小抑菌浓度从低到高依次为乙酸乙酯层6.25 mg/mL、正丁醇层12.5 mg/mL、水提物18.75 mg/mL、氯仿层37.5 mg/mL和水层37.5 mg/mL;对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度从低到高依次为乙酸乙酯层3.125 mg/mL、正丁醇层12.5 mg/mL、水提物18.75 mg/mL、氯仿层50 mg/mL和水层50 mg/mL。由上可知,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度以乙酸乙酯层最低,其次是正丁醇层,然后是水提物,而氯仿层和水层的最小抑菌浓度接近且较高。

表2　青砖茶提取物不同极性部位 对试验菌的最小抑菌浓度(mg/mL)Table 2　The minimum bacteriostasis concentration of different polar fractions from Qingzhuan brick tea extract(mg/mL)

注:“-”表示抑制作用，不能求得最小抑菌浓度。

2.3青砖茶提取物不同极性部位中总酚含量测定

由表3可知,青砖茶提取物不同极性部位中总酚含量排序为乙酸乙酯层>正丁醇层>水提物>水层>氯仿层,且相互比较达到极显著差异水平(p<0.01)。结合它们对三种菌的最小抑菌浓度可知,乙酸乙酯层、正丁醇层、水提物中多酚的含量高低与三者对三种菌的最小抑菌浓度值大小正好相反,而氯仿层与水层中多酚含量远低于乙酸乙酯层、正丁醇层和水提物,且二者抑菌较弱。这在一定程度上表明多酚对它们的抑菌作用起了至关重要的作用,尤其是乙酸乙酯层中总多酚含量高达81.62%,意味着总多酚为其抑菌的主要成分。

表3　青砖茶提取物不同极性部位的总酚含量(%)Table 3　Total polyphenol content of different polar fractions of Qingzhuan brick tea extract(%)

注:表中不同字母表示二者比较达极显著差异水平(p<0.01)。

3　讨论

天然抑菌防腐物质无毒无害,成为当今世界各国研究的热点。而茶叶作为一种传统的纯天然植物饮品,富含有茶多酚、茶色素、茶多糖、茶皂素等多种功能性成分,相关学者通过研究表明其具有广谱、强效的抑菌作用[10-14,17-18]。本文结果表明,青砖茶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有抑菌效果,与前人研究的茶叶抑菌效果相吻合。因而在一定程度上说明青砖茶含有茶叶抑菌作用的共性成分,也说明青砖茶有开发成天然抑菌防腐物质的潜力。

研究表明,正丁醇层对三种菌的最小抑菌浓度低于水提物,而二者浓度为100 mg/mL时,正丁醇层对三种菌的抑菌圈直径小于水提物。这可能是二者浓度超过最小抑菌浓度后,它们的浓度与对三种菌的抑菌圈直径的相关系数不同所致,至于具体原因有待进一步研究。

本研究还表明,相同部位对三种菌的抑制作用有所不同,这可能是由于三种细菌在结构上的差异造成的,不同的细菌对相同成分的耐受力不同;不同部位对同一种菌抑制作用强弱不同,这显然是不同极性部位中所含的抑菌化学成分结构和数量等差异所致。而关于茶叶抑菌化学成分研究集中于茶多酚,且其抗菌活性早在100年前就被证实[19],国内外学者长期致力于茶多酚对典型食品致病菌及腐败菌的抑制作用和与多种抗生素的协同抗菌作用研究,并十分注重茶多酚破坏细胞膜的功能、对细菌特定靶蛋白的抑制作用和氧化抑菌作用等抑菌机制研究[20-29],促使茶多酚成为了目前广泛应用的天然食品保鲜剂,同时为茶多酚有望作为新型的抗菌剂应用于治疗多种细菌、真菌与病毒引起的感染提供了极其重要的科学依据。基于青砖茶提取物乙酸乙酯层的抑菌效果表现突出,茶多酚含量高达80%以上,因而下一步可以将乙酸乙酯层作为研究重点,采用柱层析、制备型液相色谱、高速逆流色谱等方法对其进行分离纯化,同时跟踪进行抑菌活性研究,探明其抑菌活性的主要酚类物质结构及抑菌作用机理,进而将其开发为植物源抑菌剂广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。

4　结论

青砖茶提取物不同极性部位氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果有所不同,其中以乙酸乙酯层的抑制效果最优,其浓度为100 mg/mL时,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径依次为29.19、27.97、27.35 mm;最小抑菌浓度依次为1.56、3.12、6.25 mg/mL;总酚为其抑菌的主要活性成分。

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Study on the inhibition of three bacterias by different polar fractions from qingzhuan brick tea extract

YANG Qing-hua1,2,3,YANG Xin-he1,2,*,FU Ben-zhong1,2,QIN Cai-qin4,HUANG Ming-jun1,2,3,LV Bang-yu1,2

(1.College of Life Science and Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China;(2.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characeristic Fruits and Vegetables,Xiaogan 432000,China;3.School of Life Science,Hubei University,Wuhan 430062,China;4.College of chemistry and materials science,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China)

Agar diffusion method was used to investigate the inhibiting effect ofStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtilisby different polar fractions inculding chloroform fraction,ethyl acetate fraction,n-butyl alcohol fraction and water layer fraction from the Qingzhuan brick tea extract,and their minimum bacteriostatic concentration and total polyphenol content were determined. The results showed that the antimicrobial activity of ethyl acetate fraction among different polar fractions was the best and the antimicrobial diameters on inhibitingStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtilisarewere respectively 29.19,27.97,27.35 mm when its concentration was 100 mg/mL. The minimum inhibitory concentrations forStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtiliswere,3.12,6.25 mg/mL,respectively. The total polyphenol content in ethyl acetate fraction was as high as 81.62% and the total polyphenol may be the main active ingredients on its bacteriostasis.

qingzhuan brick tea;extract;different polar fractions;antibacterial effect

2015-06-05

杨清华(1991-)，女，硕士，主要从事茶叶品质形成机理研究，E-mail:245804504@qq.com。

杨新河(1974-)，男，博士，副教授，主要从事茶及功能食品研究，E-mail:hbxhyang@163.com。

国家自然科学基金面上项目(31370692)；湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB573)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.017