高压脉冲电场技术改变抗氧化活性肽MMCTN的二级结构的实验研究

李　雄,郭　星,余　佩,徐　晖,林松毅

(吉林大学食品科学与工程学院,吉林长春 130062)



高压脉冲电场技术改变抗氧化活性肽MMCTN的二级结构的实验研究

李雄,郭星,余佩,徐晖,林松毅*

(吉林大学食品科学与工程学院,吉林长春 130062)

本研究以DPPH自由基清除能力为抗氧化活性衡量指标,利用双因素实验设计研究方法,探究了高压脉冲电场(PEF)的电场强度(5、10、15、20 kV/cm)和脉冲频率(1800、2400 Hz)两个因素对抗氧化肽MMCTN的抗氧化活性的影响,并且考察了PEF处理后保留时间(0、2 h)对其抗氧化活性的作用;借助傅立叶红外光谱技术(MIR)、圆二色谱技术(CD)分析了PEF处理对MMCTN的二级结构影响情况。研究发现,当电场强度为10 kV/cm,脉冲频率为2400 Hz,且PEF处理后保留2 h时,MMCTN的DPPH自由基清除能力最高,达到94.14%±0.13%;MIR光谱分析得知高压脉冲电场处理的样品功能团发生了改变;CD色谱分析得知PEF处理后的样品中α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲之间发生了相互的转化。

高压脉冲电场(PEF),DPPH自由基清除能力,傅立叶红外光谱技术(MIR),圆二色谱技术(CD)

大豆抗氧化肽(Soybean antioxidant peptides)是由大豆蛋白水解产生的具有抗氧化功能的多种肽分子的混合物,具有清除自由基、抑制脂质过氧化等功能[1-2]。利用蛋白酶水解法、发酵法等方法可以制备出具有抗氧化活性的肽[3-4],对于氨基酸序列明确的肽段,可以通过化学固相合成得到高纯度的抗氧化肽。

高压脉冲电场(Pulsed electric field,简称PEF)是一种非热加工技术,在食品领域中,PEF技术多用于杀菌、功能因子提取、酶的激活等方面[5-6]。近年来,已有利用PEF技术提高抗氧化肽活性的相关研究。例如,2011年Lin等人[7]研究发现了PEF技术能够提高蛋清源肽的抗氧化活性;2012年Wang等人[8]研究发现PEF技术能够使分子量 10～30 ku蛋清源抗氧化肽的FRAP值增加到44.23%;2014年,Wang等人[9]借助PEF技术处理还原型谷胱甘肽的DPPH自由基清除率由81.83%增加到97.40%,然而,PEF技术提高抗氧化肽活性的机制并不明确。本研究以DPPH自由基清除能力为衡量指标,利用双因素设计实验,研究PEF技术对化学合成的氨基酸序列为蛋氨酸(Met)-蛋氨酸(Met)-半胱氨酸(Cys)-苏氨酸(Thr)-天冬酰胺(Asn)的大豆源抗氧化五肽MMCTN的活性影响,并借助傅立叶红外光谱技术(MIR)和圆二色谱(CD)分析方法,初步揭示PEF技术对抗氧化肽MMCTN的二级结构影响与抗氧化活性之间的联系,为探索PEF技术提高食源性功能肽的活性机理提供技术基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

MMCTN抗氧化肽上海强耀生物科技有限公司合成;DPPH(2,2-二苯基-1-苦肼基)、溴化钾分析纯,美国Sigma公司生产;甲醇、氢氧化钠、乙醇等试剂分析纯,北京化工厂生产。

高压脉冲电场装置吉林大学殷涌光教授设计;RT-6000 酶标仪美国雷杜 Rayto 酶标仪有限公司;ZG-2 真空冷冻干燥机杭州创意真空冷冻干燥设备厂;IR Prestige-21傅里叶红外光谱仪日本岛津公司;Jasco J-810圆二色谱仪日本JASCO公司。

1.2实验方法

1.2.1双因素实验方案设计双因素实验考察了电场强度、脉冲频率对化学合成的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除能力的影响,实验设计方案如表1所示:

表1　双因素实验设计表Table 1　Design of Two-factor -at-a-time experiment

注:Aij为不同因素的处理水平。

1.2.2高压脉冲电场(PEF)的处理在室温环境下,将化学合成的抗氧化肽MMCTN用蒸馏水配制成质量浓度为8 mg/mL的处理液,用蒸馏水和乙醇将物料泵及PEF系统管路清洗两至三遍后,用物料泵抽取处理液,使处理液以3.2 mL/min的流速在电场处理装置中循环流动。开启电场装置电源,将电场强度和脉冲频率设至所需参数,PEF处理时间为2～3 min,收集处理液,测定其PEF处理后,室温保留0 h和2 h的抗氧化活性。

1.2.3DPPH自由基清除率测定方法参照文献[10-11]所述方法进行DPPH自由基清除率测定:在室温环境下,将经过PEF处理的化学合成的抗氧化肽MMCTN,向96孔板中依次加入100 μL测试液、100 μL甲醇及100 μL 0.6 mmol/L的DPPH甲醇溶液混合均匀,在室温条件下避光反应90 min,用酶标仪在515 nm处测定其吸光度AS。相同条件下,用100 μL甲醇代替测试液作为空白对照,测定其吸光度AB,DPPH自由基清除率计算公式如下:

式中:AB为200 μL甲醇与100 μL DPPH甲醇溶液的吸光度;AS为100 μL测试液、100 μL甲醇与100 μL DPPH甲醇溶液的吸光度。

1.2.4中红外光谱(MIR)测定方法依据Wang Ke等人[12]所选用的中红外光谱分析方法,设置中红外检测器测试范围为400～4000 cm-1,分辨率为4 cm-1。将溴化钾在130 ℃环境下干燥5～8 h,以备压片。将经 PEF处理后的化学合成的抗氧化肽MMCTN进行真空冷冻干燥制成冻干粉。1 mg冻干粉和200 mg溴化钾研磨混匀,压片后作为处理样,200 mg溴化钾压片作为空白样,将处理样和空白样在处理室内以 2.8 mm/s 的扫描速度自动识别,进行背景扫描和基线校正后获得 MIR 光谱图。

1.2.5圆二色谱(CD)测定方法将圆二色谱仪测定的波长范围设置为190～270 nm,样品浓度为8 mg/mL,扫描速度100 nm/min,每个样品重复扫描3次。用蒸馏水清洗两次石英样品池,再用经 PEF处理后的8 mg/mL化学合成的抗氧化肽MMCTN待测样品溶液润洗一遍,加入样品至2/3处,将比色皿放入圆二色谱仪的样品槽中进行测量。

1.2.6数据处理与统计方法实验数据采用SPSS 17.0(美国,芝加哥,SPSS公司)统计软件进行单因素方差分析、相关性分析。用独立样品的t检验差异显著性检验,结果用平均值±标准差(x±SD)表示,显著性水平为p<0.05。

2　结果与分析

2.1PEF处理对MMCTN的DPPH自由基清除率的影响

脉冲频率为1800 Hz时,不同电场强度以及PEF处理后的保留时间对化学合成的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率的影响情况如图1所示。当脉冲频率为1800 Hz时,经PEF处理后0 h测定化学合成抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率随电场强度的变化较为显著(p<0.05),当电场强度从0 kV/cm增加到10 kV/cm时,DPPH清除率从92.68%±0.09%增加到93.01%±0.12%。当电场强度为10 kV/cm时,DPPH的清除率达到最高值93.01%±0.12%。然而,当电场强度从10 kV/cm增加到20 kV/cm 时,DPPH清除率从93.01%±0.12%下降到92.65%±0.10%,而经PEF处理后2 h测定的化学合成抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率均达到93%以上,其中当电场强度为10 kV/cm时,DPPH自由基的清除率达到最高值94.14%±0.13%。测定时间的不同导致的DPPH自由基清除率的不同可能是因为溶液的介电常数发生变化,从而导致产生的电解质更容易穿透细胞膜和结合活性肽。而在电场强度为10 kV/cm时,两者都同时达到DPPH自由基清除率最高值。这个结果可能是因为肽分子内存在极化结构,通过静电力引起极化部位的互相吸引,造成结构发生变化,更易于活性部位发挥功能[13-14]。

图1　电场强度、保留时间与DPPH自由基清除率的关系Fig.1　The relationship between electric field intensity, retention time and DPPH free radical clearance注:脉冲频率为1800 Hz， 不同小写字母代表差异性显著(p<0.05)。

脉冲频率为2400 Hz时,不同电场强度以及PEF处理后的保留时间对化学合成的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率的影响情况如图2所示。在脉冲频率为2400 Hz时,抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率随电场强度的变化同样较为显著(p<0.05),当保留时间为2 h,电场强度从0 kV/cm增加到5 kV/cm时,DPPH自由基清除率从92.68%±0.07%增加到93.03%±0.03%。当电场强度为5 kV/cm时,DPPH的清除率达到最高值93.03%±0.03%,显著性地高于其他水平(p<0.05)。然而,当电场强度从5 kV/cm增加到20 kV/cm 时,DPPH自由基清除率从93.03%±0.03%下降到92.64%±0.13%。而经PEF处理后2 h测定的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率均达到93%以上,其中,当电场强度为5 kV/cm时,DPPH自由基的清除率达到最高值94.13%±0.05%。而电场强度相同的情况下,脉冲频率为1800 Hz和2400 Hz时,DPPH自由基的清除率不同可能是脉冲频率能够影响肽分子的二级结构,从而影响了抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率。

图2　电场强度、保留时间与DPPH自由基清除率的关系Fig.2　The relationship between electric field intensity, retention time and DPPH free radical clearance注:脉冲频率为2400 Hz， 不同小写字母代表差异性显著(p<0.05)。

2.2MIR图谱分析

MIR 对4000～400 cm-1范围的光谱进行了分析,并得到了MIR光谱图。由图3可以看出,经过高压脉冲电场处理的样品与未处理的样品相比较,其光谱的波动情况和未处理样品大致相同,但是吸光度发生了一些变化。图3A显示高压脉冲条件为脉冲频率1800 Hz,电场强度为5 kV/cm时,其吸光度变大,而电场强度为20 kV/cm时,其吸光度降低。图3B显示高压脉冲条件为脉冲频率2400 Hz,电场强度为5和15 kV/cm时,其吸光度比变大,而电场强度为10 kV/cm时,其吸光度降低。

图3　PEF处理样品的MIR光谱图Fig.3　The MIR spectra of PEF treated sample注：A：PEF脉冲频率为1800 Hz； B：PEF脉冲频率为2400 Hz，图4同。

PEF处理后的MMCTN的基团变化如表2所示。在未经电场处理的样品中存在-NH2和-NH(3400～3100 cm-1)吸收峰,-NH2(1650～1560 cm-1)吸收峰,O-H(3300～2500 cm-1)吸收峰,饱和C-H(3000～2800 cm-1)吸收峰,不饱和C-H(>3000 cm-1)吸收峰,-C=O(1850～1600 cm-1)吸收峰,C=C(1680～1620 cm-1)吸收峰,C-N(1360～1180 cm-1)吸收峰,C=S(1250～1000 cm-1)吸收峰,S=O(1220～1040 cm-1)吸收峰,酰胺带(1700～1600 cm-1)吸收峰,-NO2(1600～1500 cm-1和1300～1250 cm-1)吸收峰,C-O-C(1150～900 cm-1)吸收峰,S-S(550～430 cm-1)吸收峰,C-O(1300～1000 cm-1)吸收峰,-NH2(1650～1560 cm-1)吸收峰,苯环(900～690 cm-1)吸收峰。当高压脉冲电场的脉冲频率固定在1800 Hz时,当电场强度为5、10、15、20 kV/cm时,处理后的样品相比为处理样品缺少了C-O和-NH2吸收峰。当脉冲频率固定在2400 Hz时,经电场强度5 kV/cm处理的样品,其吸收峰未发生改变;电场强度为10 kV/cm时,缺失了S-S吸收峰;电场强度为15 kV/cm时,缺失了-NO2和C-O吸收峰;电场强度为20 kV/cm时缺失了S-S,C-O和苯环吸收峰。

表2　PEF处理的MMCTN中红外分析结果Table 2　Functional groups of PEF treated MMCTN analyzed by MIR

注:“+”代表样品中存在相应基团,“-”代表不存在。

经过高压脉冲电场处理的样品其MIR光谱并无明显的差异,但其吸光度和吸收峰发生了细微变化,高压脉冲电场改变MMCTN化学合成抗氧化肽的活性,可能是由于这些变化引起的。

2.3CD图谱分析

经过PEF处理的抗氧化肽MMCTN测得的CD图谱如图4所示。图4A展示了脉冲频率固定在1800 Hz,不同电场强度下抗氧化肽MMCTN的CD图谱,从该图可以看出经PEF处理的抗氧化肽MMCTN在240～260 nm处有一个负的吸收峰,且CD图谱的谱线大致重合,说明PEF处理后的抗氧化肽MMCTN,其二级结构的种类并未发生变化。脉冲频率固定在2400 Hz时,不同电场强度下抗氧化肽MMCTN的CD图谱如图4B所示,同样,经PEF处理的抗氧化肽MMCTN在240～260 nm处有一个负的吸收峰,且其二级结构的种类并未发生变化。

图4　PEF处理的抗氧化肽MMCTN的CD图谱Fig.4　The CD spectra of PEF treated sample

PEF处理的MMCTN的CD图谱分析结果如表3所示。未经PEF处理的抗氧化肽MMCTN含有α螺旋,β转角和无规则卷曲三种二级结构,其百分比分别占12.5%,33.1%,54.4%。经过不同电场强度的PEF处理的抗氧化肽MMCTN,其二级结构的种类并未发生变化,但是含量发生了改变。当脉冲频率为1800 Hz,电场强度为20 kV/cm时,α螺旋的含量降低到7.9%,而经其他PEF条件处理的样品α螺旋的含量均得到了提高。脉冲频率为2400 Hz,电场强度为10 kV/cm时,抗氧化肽MMCTN中出现了8.4%的β折叠,而其他处理样品以及未经处理的抗氧化肽MMCTN中并未发现该二级结构。当脉冲频率固定在2400 Hz,电场强度为10 kV/cm时,处理样品的β转角含量有所下降;电场强度为15 kV/cm时,处理样品的β转角含量没有变化;而其他样品的β转角含量有所增加。经脉冲频率1800 Hz,电场强度为20 kV/cm处理的样品,其无规则卷曲的含量增加了2.7%,而其余PEF处理的样品无规则卷曲的含量均减少了。因此可以发现,经PEF处理的抗氧化肽MMCTN的二级结构之间发生了转化,或许这是由于经PEF处理时,强大的电场力造成的,而这些二级结构间的相互转化是否会影响抗氧化肽MMCTN的活性需要进一步的研究证明。

表3　PEF处理的MMCTN的CD图谱分析结果(%)Table 3　Results of PEF treated MMCTN analyzed by CD(%)

3　结论

本研究借助双因素实验设计的方法,对抗氧化肽MMCTN进行PEF处理,获知当电场强度为10 kV/cm,脉冲频率为2400 Hz,且PEF处理后保留2 h时,MMCTN的DPPH自由基清除能力最高,达到94.14%±0.13%。经MIR光谱和CD色谱分析,高压脉冲电场改变MMCTN化学合成抗氧化肽的活性,可能是处理后的样品中功能基团有一定的改变,其α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲之间相互转化引起的。本研究为探索PEF技术提高食源性功能肽的活性机理提供了技术基础。

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Secondary structure of MMCTN treated by pulsed electric field(PEF)technology

LI Xiong,GUO Xing,YU Pei,XU Hui,LIN Song-yi*

(College of Food Science and Technology,Jilin University,Changchun 130062,China)

DPPH radical scavenging capacity was used as measuring indices of antioxidant activity In this research. Two-factor-at-a-time experiment was used to investigate the pulsed electric field(PEF)effects on antioxidant activity of MMCTN and the two factors were electric filed intensity(5,10,15,20 kV/cm)and pulse frequency(1800,2400 Hz). And the effects of retention time(0,2 h)after PEF treatment on antioxidant activity were investigated. Then,mid-infrared spectroscopy(MIR)and circular dichroism spectrum(CD)were used to analyze the secondary structure changes of PEF treated MMCTN. The results showed that when the electric filed intensity was 10 kV/cm,pulse frequency was 2400 Hz and retention time was 2 h,the DPPH radical scavenging capacity was up to 94.14%±0.13%. The MIR showed that the functional groups of PEF treated samples were changed and the CD indicated thatαhelices,βstrands,βturn and random coil were interconverted.

Pulsed electric field(PEF);DPPH radical scavenging capacity;Mid-infrared spectroscopy(MIR);Circular dichroism spectrum(CD)

2015-06-03

李雄(1995-),男,本科,研究方向:营养与功能性食品,E-mail:980066308@qq.com。

林松毅(1970-),女,博士,教授,研究方向:营养与功能性食品,E-mail:linsongyi730@163.com。

国家”十二五”科技支撑计划项目(2012BAD33B03);吉林大学本科生2015年度创新训练国家级培育项目(2015831277)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.006