酵母菌与乳酸菌发酵对小米淀粉粘度的影响

寇　芳,康丽君,张莉莉,尹　婧,李文杰,王维浩,2,夏天天,宁冬雪,曹龙奎,2,*

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;2.黑龙江八一农垦大学食品学院 国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319)



酵母菌与乳酸菌发酵对小米淀粉粘度的影响

寇芳1,康丽君1,张莉莉1,尹婧1,李文杰1,王维浩1,2,夏天天1,宁冬雪1,曹龙奎1,2,*

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;2.黑龙江八一农垦大学食品学院 国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319)

自然发酵受环境和微生物的影响大,难实现发酵产品的大规模生产。故研究自然发酵优势菌对小米淀粉的影响很有必要。选取内蒙古赤峰生产的黄金苗小米为原料,利用自然发酵纯化的酵母菌与乳酸菌为菌种进行纯种发酵96 h,并且与自然发酵后的小米淀粉比较,分析淀粉的粘度、衰减值和回生值的变化。采用0.2 g/100 mL的NaOH溶液提取3 h的方法来提取发酵后小米中的淀粉,并对其发酵液中固形物的含量、pH、淀粉的粘度特性、偏光十字进行测定。结果表明,三种发酵方法所得的发酵液中总固形物的含量都增加;较自然发酵相比,发酵前24 h乳酸菌和酵母菌发酵液中的pH下降迅速,之后变化缓慢;淀粉粘度特性表明,乳酸菌和酵母菌发酵终止时,其粘度的起始温度、衰减值、回生值较自然发酵相比都下降,峰值粘度较自然发酵相比都上升,乳酸菌发酵和酵母菌发酵的最终粘度与自然发酵相比有所增加,偏光十字显示无论是自然发酵酵母菌发酵还是乳酸菌发酵,发酵后的淀粉颗粒仍具有偏光十字,说明发酵未改变淀粉的结晶结构。

小米淀粉,自然发酵,酵母菌发酵,乳酸菌发酵,粘度特性

小米中碳水化合物占小米总重的63%～70%,其中淀粉占56%～61%[1],蛋白质含量为9.28%,其蛋白质的消化率为83.4%[2]。市场上用发酵法制得的小米产品不仅可以改善小米制品的成团性,还可以改善小米制品的口感和风味。此外在发酵过程中,还会产生许多小分子物质如单糖、双糖、游离脂肪酸、乳酸、醋酸等[3]。因此研究自然发酵中优势菌对小米淀粉粘度的影响具有非常广阔的发展前景。

自然发酵过程中的微生物主要是为细菌、酵母菌以及少量霉菌等[4]。通过实践发现,自然发酵过程中微生物的菌群变化,主要以乳酸菌和酵母菌居多,而霉菌主要在发酵液表面,且数量相对酵母菌和乳酸菌少。并且乳酸菌和酵母菌在发酵过程中一直占有绝对优势,是自然发酵过程中的主要优势菌种。利用自然发酵过程中筛选并鉴定出的乳酸菌和酵母菌为菌种将小米发酵96 h,通过对比自然发酵与乳酸菌和酵母菌的发酵过程中小米淀粉的粘度特性,来探讨自然发酵过程中两种菌的发酵机理。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

小米黄金苗小米(内蒙古赤峰小米);氢氧化钠天津市大茂化学试剂厂;盐酸广州万从化工有限公司;其它试剂皆为国产分析纯。

AR2140型分析天平瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司;S220型pH计瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司;TGL16B型台式离心机上海安亭科学仪器厂制造;DGG-9053A型恒温箱上海森信实验仪器有限公司;MJ-10A型磨粉机上海市浦恒信息科技有限公司;RVA4500型快速黏度分析仪瑞典波通仪器公司;RVA专用搅拌桨瑞典波通仪器公司;RVA专用铝盒瑞典波通仪器公司;NP-80系列透反射偏光显微镜宁波永新光学股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1发酵小米样品制备

1.2.1.1菌种制备小米与水的比例为1∶1.2(g/mL)加入蒸馏水,30 ℃下自然发酵96 h后,从发酵液中筛选出优势微生物菌群,通过分离纯化和生理生化鉴定其为乳酸菌和酵母菌,并将优势菌扩大培养。具体方法为:乳酸菌纯化并鉴定后,接种至MRS液体培养基在37 ℃下增殖培养24～48 h,直到乳酸菌菌悬液浓度达到5×108cfu/mL。酵母菌纯化鉴定后,接种到YEPD液体培养基上28 ℃下增殖培养24～48 h,直到酵母菌菌悬液浓度达到5×108cfu/mL。

1.2.1.2发酵小米乳酸菌和酵母菌发酵:每种发酵分别取4份小米,每份150 g,用灭菌蒸馏水清洗三遍后置于500 mL烧杯中,加入无菌蒸馏水(小米与无菌水的比例为1∶1.2 g/mL)。吸取扩大培养后的微生物菌悬液(乳酸菌,酵母菌)5 mL接种到小米中,用保鲜膜密封,分别在最适温度(乳酸菌37 ℃,酵母菌28 ℃)下培养96 h进行发酵。

自然发酵:取小米150 g,按小米与水的比例为1∶1.2(g/mL)加入蒸馏水,30 ℃下自然发酵96 h。

1.2.1.3发酵小米淀粉的制备将发酵完并且过筛后的小米用0.2 g/100 mL的NaOH溶液,料液比1∶3(g/mL),提取3 h,3000 r/min的离心机离心10 min,弃去上清液,剥刮除去沉淀区中上层黄褐色的物质,水洗,连续离心,剥刮,水洗,直至淀粉浆呈白色。用1 mol/L HCl调浆至pH7.0中性,离心,30 ℃干燥,过80目筛,即得淀粉成品。

1.2.2发酵过程中固形物含量的测定每隔24 h分别从上述发酵方式中取出一份发酵样品,用移液管分别吸取10 mL的发酵液于恒重的坩埚中,105 ℃烘至恒重。

固形物的含量(g/mL)=(m2-m1)/10

式中,m1为坩埚的质量,m2为加入发酵液后烘至恒重的坩埚质量。

1.2.3发酵过程中pH的测定每隔24 h用pH计分别测量每个样品发酵液的pH。

1.2.4粘度特性的测定利用快速粘度分析仪(RVA)测试小米淀粉糊粘度。称取样品3.500 g(干基)于样品盒中,加水25 mL,35 ℃保温3 min,以6 ℃/min的速率加热到95 ℃,保温5 min,以6 ℃/min的速率降温到50 ℃。用仪器配套的软件分析得到曲线。

1.2.5淀粉偏光十字的测定配成1%的淀粉悬液,混匀使淀粉颗粒充分分散,滴1滴于洁净的载玻片上,置于偏光显微镜的载物台上观察不同发酵处理的小米淀粉,并拍摄其照片。

1.3数据统计分析

采用excel软件对数据统计分析。

2　结果与分析

2.1发酵过程中固形物的测定

小米在发酵的过程中,因为浸泡以及微生物菌群产酸产酶的缘故,使得小米中的物质随发酵时间的延长而溶出,固形物含量的变化反映了小米中物质的溶出情况,不同发酵处理过程中的固形物含量的变化如图1所示。

图1　总固形物含量的变化 Fig.1　The variation in content of total solids

根据图1可知,不同处理小米发酵液中总固形物含量都随着发酵时间的延长而增加,但酵母菌发酵液固形物的含量随着发酵时间的延长呈先快速增加后缓慢增加的趋势。而乳酸菌发酵和自然发酵的总固形物含量在逐步增加。说明发酵可使小米中部分物质分解或溶出,使发酵液中总固形物含量增加。发酵液中总固形物含量的增加一方面由于发酵过程中微生物的代谢产生的酸和酶作用于小米的无定形区,使小米中一些大分子及不溶性的物质被分解成小分子物质,被微生物利用或溶解在发酵液中;另一方面是由于小米在发酵的过程中一直浸泡在发酵液中,使得小米中可溶性的蛋白、脂类及其他成分溶解到发酵液中。所以无论哪种发酵方式,其发酵液中的总固形物的含量都会有所增加。

表1　不同发酵RVA谱特征值

注:Z代表自然发酵,R代表乳酸菌发酵,J代表酵母菌发酵，图中标有不同字母的回生值表示该发酵类型随发酵时间的延长其回生值差异显著(p<0.05)。

2.2发酵过程中pH的测定

不同微生物菌群在发酵过程中,发酵液pH的变化情况如图2所示。

图2　发酵过程中pH的测定Fig.2　The determination of pH in the fermentation process

由图2可知,对于自然发酵来说,其发酵过程中微生物产酸的能力相对较弱。在发酵的前48 h,发酵液的pH下降到4.5以下,之后的发酵过程中pH下降的速度非常缓慢。与自然发酵相比,乳酸菌在发酵的前24 h,发酵液中的pH急剧下降,其pH可达到4.0以下,而发酵24 h以后,其pH的下降的趋势趋于平缓。说明在发酵的前24 h,乳酸菌迅速增长,代谢活动旺盛,并大量产酸,使得发酵液产生比较柔和的酸味,有效的抑制了杂菌的生长。而酵母菌在发酵的前24 h,其发酵液的pH迅速下降至4.5左右,并且随着发酵时间的延长,其pH在逐渐降低。但与乳酸菌相比,其pH下降的趋势要小于乳酸菌。同乳酸菌发酵相比,酵母菌发酵的过程中会产生柔和的酒香。

2.3粘度特性的测定

对比自然发酵,酵母菌发酵和乳酸菌发酵不同发酵时间对小米淀粉粘度特性的影响如表1所示。

用excel软件对三种不同发酵方式所得小米淀粉的回生值进行相关性分析,可得到回归方程如下:

y=5.6042x+1888(R2=0.99886)

式(1)

y=-149.8x+2279(R2=0.9955)

式(2)

式(1)代表自然发酵小米粉其回生值随发酵时间变化的回归方程,由式(1)可以看出发酵时间对自然发酵回生值的影响呈正相关;式(2)代表乳酸菌发酵随发酵时间的变化其回生值的回归方程,由式(2)可以看出发酵时间对乳酸菌发酵回生值的影响呈负相关。

表2　不同发酵第4d的粘度特性

图3　粘度特性的测定Fig.3　The determination of viscosity characteristics注：1.乳酸菌发酵,2.酵母菌发酵,3.自然发酵。

表1可以看出,发酵时间对自然发酵,乳酸菌发酵和酵母菌发酵小米淀粉的糊化温度的影响较小,其变异系数分别为0.01%和0.01%,0.01%。自然发酵淀粉的糊化温度在发酵前48 h先下降后上升,而酵母菌发酵和乳酸菌发酵在发酵的第72 h糊化温度下降,之后上升。但无论是乳酸菌发酵还是酵母菌发酵,在发酵终止时其糊化温度都比自然发酵时的糊化温度要低。其原因可以解释为发酵使部分蛋白质分解或溶出[5],消除了一些蛋白对淀粉糊化的阻碍作用,因而淀粉颗粒在糊化时更容易吸水膨胀,促进了淀粉的糊化使糊化温度降低[6];自然发酵的峰值粘度随发酵时间的延长逐渐降低,而酵母菌和乳酸菌在发酵的前72 h其峰值粘度逐渐下降,之后呈上升趋势。但无论是乳酸菌发酵还是酵母菌发酵,其发酵前72 h峰值粘度都比自然发酵要低。其峰值黏度的减小可能是因为淀粉无定形区支链淀粉的断链与脱支所引起的。峰值黏度的降低是由于发酵后淀粉在热水中的可溶性更大或发酵过程中产生更短链淀粉所引起的;从表1可以看出发酵时间对乳酸菌发酵淀粉的衰减值影响相对较大,而对酵母菌发酵的影响相对较小。自然发酵和酵母菌发酵前72 h的衰减值都呈下降趋势,而乳酸菌发酵则一直呈下降的趋势,并且在发酵的过程中酵母菌和乳酸菌发酵的衰减值都比自然发酵过程中的衰减值小;发酵时间对自然发酵和乳酸菌发酵回生值的影响差异显著,对酵母菌发酵的回生值影响相对于二者较小,但三种发酵方式的变异系数较小。自然发酵的回生值逐渐增大,酵母菌的回生值在发酵的前72 h先减小之后增大,而乳酸菌的回生值则一直减小。发酵所产的酸和酶作用于淀粉颗粒的无定形区,使支链淀粉长链断链,从而降低了单个支链淀粉分子的分支化程度,降低了淀粉再结晶的程度,延缓支链淀粉老化倾向。

结合图3和表2可以看出,乳酸菌发酵,酵母菌发酵第96 h(发酵终止)RVA的变化同自然发酵相比有很大差别,分别体现在:淀粉糊化的起始温度较自然发酵相比分别下降0.9 ℃和2.85 ℃;峰值粘度较自然发酵相比分别上升185 cP和103 cP。其原因是由于乳酸菌和酵母菌发酵过程中蛋白质明显减少,使淀粉颗粒在糊化的过程中更易吸水膨胀至更大的体积,故峰值黏度增加。Lim 等研究表明,大米粉中蛋白含量的减少可引起大米粉峰值黏度增加[7]。此外,发酵后大米粉中脂肪含量降低,也可以使峰值黏度增加[8];最终粘度是冷湖在低剪切作用下稳定性的评估。较自然发酵相比乳酸菌发酵和酵母菌发酵的最终粘度变大;衰减值较自然发酵都呈下降的状态,R4下降978 cP,J4下降400 cP。由于支链淀粉的长链部分与淀粉糊化的衰减值呈负相关,而短链部分与淀粉糊化的衰减值呈正相关[9],长链可以提供更强的相互交联作用来维持膨胀淀粉颗粒的刚性,在加热搅拌过程中,不易破裂。乳酸菌和酵母菌发酵后支链淀粉链长变化可能是淀粉衰减值降低的重要原因[10]。衰减值的降低,说明发酵后的小米淀粉在加热过程中维持颗粒结构完整性的能力增强;回生值反映了糊化后淀粉的稳定性和老化趋势,RVA 是在十几分钟内完成的,故应属于测定淀粉的短期老化特性。乳酸菌和酵母菌发酵的回生值与自然发酵的相比,回生值均有降低,分别下降743 cP和471 cP。这说明乳酸菌和酵母菌发酵改变了小米淀粉的化学成分而影响其回生特性,使淀粉的短期老化能力都有所下降。

2.4偏光十字

淀粉颗粒内部存在结晶结构和无定形结构,而淀粉分子结晶区具有高度有序的排列,而在非结晶区淀粉分子呈无序的排列,正是这两种不同的结构在密度和折射率上存在差别,使得淀粉颗粒产生各向异性的现象,当偏振光通过淀粉颗粒时就会产生偏光十字[11]。在偏光显微镜下观察淀粉颗粒呈现黑色的十字,将颗粒分成四个白色的区域,称为偏光十字或马耳他十字[12]。

淀粉颗粒通过改性后,其内部的分子链有序排列的结晶结构就会遭到破坏,偏光十字就会发生改变或消失,所以淀粉颗粒内部偏光十字的变化在一定程度上可以反映出淀粉颗粒结晶结构是否发生变化。不同发酵时间小米淀粉的偏光十字如图4所示。

图4　小米淀粉偏光十字Fig.4　The polarization cross of millet starch注：a：自然发酵,b：酵母菌发酵,c：乳酸菌发酵。

如图所示三种不同发酵方式所制得的淀粉都有明显的偏光十字,说明乳酸菌发酵,酵母菌发酵同自然发酵相比,都未使淀粉颗粒的结晶区发生改变。发酵过程中微生物代谢产生的有机酸和酶可能主要作用于淀粉的无定形区,而结晶区几乎保持不变。

3　结论

自然发酵过程中的主要优势菌种酵母菌与乳酸菌在发酵时起非常重要的作用。主要体现在四个方面:自然发酵,酵母菌发酵和乳酸菌发酵液中总固形物的含量都增加,但酵母菌发酵和乳酸菌发酵液中的总固形物含量要高于自然发酵过程中的发酵液的总固形物含量。较自然发酵相比,乳酸菌和酵母菌在发酵的前24 h发酵液中的pH下降迅速,24 h以后趋于稳定。发酵终止时乳酸菌和酵母菌发酵小米淀粉的糊化起始温度、回生值、衰减值较自然发酵下降,峰值粘度、最终粘度上升。回生值的降低有利于改善小米产品的回生特性,耐于储存。偏光十字表明了无论是哪种发酵方式,发酵后的淀粉颗粒仍具有偏光十字。说明三种发酵方式未使淀粉的结晶结构改变。

由于本文研究主要以乳酸菌群,酵母菌群为主要研究对象,通过对比分析自然发酵来确定其发酵机理,所以对于乳酸菌和酵母菌群中哪种菌对发酵

起主要作用还不是很清楚,所以接下来的工作就是通过确定自然富集的乳酸菌和酵母菌群中何种菌对发酵起实质性的作用进行探讨和研究。

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Effect on yeast and lactic acid bacteria fermentation of millet starch viscosity

KOU Fang1,KANG Li-jun1,ZHANG Li-li1,YIN Jing1,LI Wen-jie1,WANG Wei-hao1,XIA Tian-tian1,NING Dong-xue1,CAO Long-kui1,2,*

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.Heilongjiang Farm Produce Processing Development Center,Daqing 163319,China)

Natural fermentation was affected heavily by environment and microbes,it was difficult to achieve the mass production of the fermentation products . Therefore, studying natural fermentation of advantage bacterium to the effect on millet starch was necessary. Selected millet production from Inner Mongolia chifeng Huang Jinmiao as raw material,species by natural fermentation and purification of yeast and lactic acid bacteria were used for pure breed fermentation for 96 h,and compared with natural fermentation of millet starch,the changes of starch viscosity,attenuation and retrogradation value were analyzed. Using 0.2 g/100 mL NaOH solution to extract the methods of extracting 3 h after fermentation of millet starch, and the solids content in the fermented liquid,pH,the starch viscosity property,polarization cross were determined. The results showed that all of the total solids content by three methods of fermentation in the fermented liquid were increased,compared to natural fermentation, the fermentation of lactic acid bacteria and yeast fermentation liquor of pH were declined rapidly before 24 h,then changed slowly. Starch viscosity properties showed that lactic acid bacteria and yeast fermentation termination,the attenuation of the starting temperature,viscosity value,the setback were decreased compared to natural fermentation,the peak viscosity rose more than natural fermentation. Compared with natural fermentation,the final viscosity lactic acid bacteria and yeast fermentation were increased. polarization cross showed both natural fermentation of yeast fermentation and lactic acid bacteria fermentation,starch particles after the fermentation still had the polarization cross,the fermentation did not change the crystalline structure of starch.

Millet starch;natural fermentation;yeast fermentation;fermentation of lactic acid bacteria;viscosity property

2015-12-08

寇芳(1993-)，女，硕士研究生，研究方向:杂粮发酵，E-mail:18249556388@163.com。

曹龙奎(1965-)，男，博士，研究方向：农产品加工，E-mail：caolongkui2013@163.com。

杂粮专用粉制备及方便面技术集成应用与示范；国家星火计划项目(2013GA670001)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.003