恶性肿瘤患者益生菌活性与抗菌药物使用相关性研究

张红旭　韩　枫　黄金岳　凌　心　刘广锋　王　艳.徐州医学院附属医院药学部，江苏徐州　00；.江苏省徐州市肿瘤医院药剂科，江苏徐州　005；.江苏省徐州市肿瘤医院检验科，江苏徐州　005

恶性肿瘤患者益生菌活性与抗菌药物使用相关性研究

张红旭1,2韩枫2黄金岳2凌心2刘广锋3王艳1
1.徐州医学院附属医院药学部，江苏徐州221002；2.江苏省徐州市肿瘤医院药剂科，江苏徐州221005；3.江苏省徐州市肿瘤医院检验科，江苏徐州221005

目的 研究恶性肿瘤患者益生菌活性与抗菌药物使用的相关性。方法 选取2012年6月～2015年12月徐州医学院附属医院（以下简称“我院”）首诊首治的早期恶性肿瘤患者（恶性肿瘤组）137例以及我院同期健康体检者（健康对照组）183名作为研究对象，采用平板计数法检测恶性肿瘤组及健康对照组粪便中细菌总数和乳酸菌数量，分析恶性肿瘤组细菌总数、乳酸菌数量与近三年抗菌药物累积使用量的相关性。结果 根据抗菌药物使用史及近三年抗菌药物使用量，将恶性肿瘤组分为低天数组（1～25 d，72例）、中天数组（＞25～50 d，38例）、高天数组（＞50 d，27例）。恶性肿瘤组细菌总数增加，而乳酸菌数量减少，与健康对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。恶性肿瘤组细菌总数与抗菌药物累积使用量呈低度正相关（r=0.452，P＜0.05），乳酸菌数量与抗菌药物累积使用量呈低度负相关（r=-0.476，P＜0.05）。结论 在一定时间段内，抗菌药物累积使用达到一定量后，恶性肿瘤患者益生菌活性与抗菌药物使用存在低度负相关。

恶性肿瘤；益生菌；乳酸菌；活性；抗菌药物；相关性

［Abstract］Objective To study the correlation between the activity of probiotics and antibiotics use in the patients with malignant tumor.Methods One hundred and thirty seventy patients with malignant tumor（malignant tumor group）first diagnosed and treated in the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College（"our hospital"for short）and 183 health persons（healthy control group）for the corresponding period in our hospital from June 2012 to December 2015 were selected as research objects.The total number of bacteria and the number of lactobacillus in the feces of malignant tumor group and healthy control group were detected by using plate count method.The correlation of the total number of bacteria and the number of lactobacillus with cumulative amount of antibiotics use in recent 3 years was analyzed.Results According to the history of antibiotics use and the cumulative amount of antibiotics use in recent three years，the malignant tumor group was divided into the low days group（1-25 days，72 cases），the moderate days group（＞25-50 days，38 cases）and the high days group（＞50 days，27 cases）.The total number of bacteria of the malignant tumor group was increased significantly，while the number of lactobacillus was significantly decreased，compared with the healthy control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.There was a weakly positive correlation between the total number of bacteria and cumulative amount of antibiotics use of the malignant tumor group（r=0.452，P＜0.05）；there was a weakly negative correlation between the number of lactobacillus and cumulative amount of antibiotics use of the malignant tumor group（r=-0.476，P＜0.05）.Conclusion There is a weakly negative correlation between activity of probiotics and antibiotics use in malignant tumor patients after antibiotics cumulative use reaches a certain amount in a certain period of time.

［Key words］Malignant tumor；Probiotics；Lactobacillus；Activity；Antibiotics；Correlation

健康人体肠道存在着大量细菌，形成一个相互制约的微生态系统，具有相对的稳定性，是维持肠道功能、维持肠黏膜屏障完整、拮抗病原微生物的定植、调控人体免疫功能的重要因素，对保证人体健康有重要意义；益生菌指摄入足够数量后可对宿主的健康产生有益作用的活性微生物，目前国际上公认乳酸菌是最具代表性的肠内益生菌，乳酸菌（尤其是乳杆菌和双歧杆菌）几乎成为益生菌的代名词。益生菌主要通过调节宿主体内的菌群平衡发挥增强机体免疫力和抗肿瘤作用［1-7］。体内益生菌减少与菌群失调可以导致机体免疫力下降，使肿瘤发生成为可能。乳酸菌在生物学上是革兰阳性、厌氧或兼性厌氧，所以大多数抗细菌药都对其有杀灭或抑制作用。

以往，对抗菌药物不合理使用危害的研究和报道主要集中在细菌耐药性、毒性及过敏反应，近年国外学者通过回顾性研究认为肿瘤的发生、发展、形成与抗菌药物累积使用具有相关性，但机制尚未揭示［8-11］。本研究拟通过考察肿瘤患者体内益生菌活性与抗菌药物使用的相关性，揭示抗菌药物使用作为肿瘤危险因素的机制，为促进抗菌药物合理使用和肿瘤预防提供理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料

恶性肿瘤组：选取2012年6月～2015年12月徐州医学院附属医院（以下简称“我院”）首诊首治的早期恶性肿瘤患者137例，其中男64例，女73例；宫颈癌9例，乳腺癌46例，甲状腺癌34例，肾癌7例，膀胱癌37例，鼻咽癌2例，肝癌2例；年龄24～76岁，平均（54.8±3.8）岁。所有病例均经病理、CT等确诊，未经放疗或化疗。入组条件：①首诊首治的恶性肿瘤患者；②肿瘤分级分期较早；③经流行病学调查无肿瘤危险因素史；④有抗菌药物使用史。排除标准：近期有胃肠疾病史、在调查前2周内使用过抗菌药物。健康对照组：选取我院健康体检中心同期健康体检者183名，其中男86名，女97名，年龄25～72岁，平均（56.4± 5.1）岁。入组条件：①同期健康体检者；②无抗菌药物使用史。排除标准：①近三年有免疫系统疾病史；②近期有胃肠疾病史，在调查前2周内均使用过抗菌药物。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2材料

1.2.1样品采集粪便：将在医院现场采集到的新鲜粪便样品迅速装于灭菌管中，封好放入冷藏厌氧盒中，立刻带回实验室进行分离。

1.2.2培养基TTC营养琼脂、MRS琼脂（青岛海博生物科技有限公司）。

1.2.3试剂乳酸菌成套鉴定生化管、V-P试剂盒、硝酸盐还原试剂盒、吲哚试剂盒（青岛海博生物科技有限公司）。

1.2.4仪器与设备MJQ70-Ⅰ型压力蒸汽灭菌器 （徐州四方医疗器械公司）；奥林巴斯CX21BIM-SET5生物显微镜 （奥林巴斯公司）；METTLER TOLEDD电子天平［梅特勒-托利多量仪器（上海）有限公司］；超净工作台（苏州市姑苏空调净化有限公司）；2.5 L圆底立式厌氧培养袋、2.5 L厌氧产气包、厌氧指示剂（青岛海博生物科技有限公司）；XK97-A菌落计数器（江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司）。

1.3方法

以抗菌药物使用为研究因素，通过合理配对，减少混杂因素的影响，采用病例对照研究进行恶性肿瘤患者益生菌活性与抗菌药物使用相关性单因素研究。

1.3.1问卷调查参照国家癌症中心城市癌症早诊早治项目防癌风险评估问卷表制订调查表，内容包括年龄、性别、饮食习惯、生活习惯、心理和情绪、既往史、恶性肿瘤家族史、抗菌药物使用史（近三年累积使用天数）等人口学信息，调查以面谈为主，辅以调查病历记录。

1.3.2细菌总数的测定取出采集的新鲜粪便样品中间部分，称取1.0 g样品，加入到装有9.0 mL无菌生理盐水的试管中，吸取菌液进行10倍梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个稀释度，按10-6～l0-1的顺序分别吸取各稀释度的供试液1 mL注入直径9 cm的平皿内，用经灭菌并冷却到45～50℃的细菌培养基倾倒平板，37℃培养48 h，观察并记录细菌数目［12］。

1.3.3乳酸菌的分离、计数取出采集的新鲜粪便样品中间部分，称取1.0 g样品，加入到装有9.0 mL无菌生理盐水的试管中，吸取菌液进行10倍梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-44个稀释度，按10-4～l0-1的顺序分别吸取各稀释度的供试液1 mL注入直径9 cm的平皿内，用经灭菌并冷却到45～50℃改良MRS固体培养基倾倒平板，37℃厌氧培养48 h，计数［12］。

1.3.4乳酸菌的初步鉴定形态学鉴定：对分离得到的乳酸菌进行菌落形态观察，进行革兰染色；生理生化鉴定：按照《伯杰氏细菌鉴定手册》中乳酸菌的生化特性，分别进行触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、硫化氢试验、吲哚试验、葡萄糖产酸产气试验、碳水化合物发酵产酸试验、运动性实验，检测在pH 4.5，温度15、45℃，6.5%NaCl条件下的生长情况［12］。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。数据正态性检验采用矩法检验，正态分布计量资料采用均数±标准差（±s）表示，方差齐性检验采用Bartlett检验，两组计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1问卷调查结果

调查恶性肿瘤组及健康对照组以往抗菌药物使用史及近三年抗菌药物使用量（以抗菌药物累积使用天数为指标），根据文献及预实验结果将恶性肿瘤组分为低天数组、中天数组、高天数组，见表1。

表1　恶性肿瘤患者抗菌药物使用量调查结果

2.2乳酸菌的鉴定结果

2.2.1形态学鉴定乳酸菌在厌氧条件下生长良好，菌落呈乳白色、表面光滑，涂片镜下观察革兰染色为阳性，见图1～2。

图1　乳酸菌在MRS平板上的菌落形态

图2　乳酸菌的光学显微镜下形态学（革兰染色，10×100）

2.2.2菌类鉴定符合乳酸菌的性质：已分离的乳酸菌均为革兰染色阳性，不运动，在H2O2酶实验、H2S实验、明胶液化实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产气实验呈阴性，都能在15℃、45℃、pH 4.5、6.5% NaCl条件下生长良好，不发酵蔗糖和木糖，能发酵葡萄糖和乳糖。

2.2.3乳酸菌在光学显微镜下的形态学特性乳酸菌细胞形态为多形性，呈细长杆状、较粗杆状、球杆状等，排列呈栅栏状、链状等，见图2。

2.3细菌及乳酸菌检测结果

2.3.1两组细菌、乳酸菌数量检测结果比较恶性肿瘤组与健康对照组细菌、乳酸菌数量检测结果比较显示，恶性肿瘤组细菌总数明显增加，而乳酸菌数量明显减少，与健康对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；低天数组与健康对照组在细菌总数和乳酸菌数量差异无统计学意义（P＞0.05）；中、高天数组与健康对照组在细菌总数和乳酸菌数量差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表2　两组细菌、乳酸菌数量检测结果比较（±s）

表2　两组细菌、乳酸菌数量检测结果比较（±s）

注：“*”代表各组与健康对照组比较的统计结果；“-”代表无数据

组别　例数　细菌总数（×106cfu/g）*t值　P值　乳酸菌数量（×103cfu/g）*t值　P值健康对照组恶性肿瘤组低天数组中天数组高天数组183 137 72 38 27 7.8±2.6 10.2±3.8 8.2±4.3 11.6±3.1 13.7±3.5 ----2.106 1.667 2.345 2.742 0.036 0.146 0.033 0.008 7.2±0.7 4.4±0.4 6.3±0.6 2.9±0.5 1.4±0.3 2.715 1.567 2.726 3.329 0.028 0.152 0.027 0.007

2.3.2恶性肿瘤组细菌总数、乳酸菌数量检测结果组间比较恶性肿瘤组细菌总数、乳酸菌数量组间比较分析显示，低天数组细菌总数、乳酸菌数量与中天数组、高天数组比较差异均有统计学意义 （均P＜0.05），中天数组细菌总数、乳酸菌数量与高天数组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3　恶性肿瘤组细菌、乳酸菌数量检测结果组间比较（±s）

表3　恶性肿瘤组细菌、乳酸菌数量检测结果组间比较（±s）

注：P1代表低天数组与中天数组比较，P2代表低天数组与高天数组比较，P3代表中天数组与高天数组比较

组别　例数 年龄（岁）细菌总数（×106cfu/g）乳酸菌数量（×103cfu/g）低天数组中天数组高天数组F值P值P1值P2值P3值72 38 27 53.5±16.3 52.3±12.6 62.4±11.2 8.2±4.3 11.6±3.1 13.7±3.5 4.751 0.037 0.035 0.026 0.041 6.3±0.6 2.9±0.5 1.4±0.3 5.254 0.024 0.021 0.014 0.028

2.3.3相关性分析恶性肿瘤患者体内细菌总数、乳酸菌数量与患者近三年抗菌药物累积使用量相关性分析结果显示，恶性肿瘤组细菌总数与抗菌药物累积使用量呈低度正相关（r=0.452，P＜0.05）；恶性肿瘤组乳酸菌数量与抗菌药物累积使用量呈低度负相关（r= -0.476，P＜0.05）；低天数组细菌总数与抗菌药物累积使用量无相关性（r=0.165，P＞0.05），乳酸菌数量与抗菌药物累积使用量无相关性 （r=-0.138，P＞0.05）；中天数组、高天数组细菌总数与抗菌药物累积使用量呈正相关（r=0.503、0.577，均P＜0.05），乳酸菌数量与抗菌药物累积使用量呈负相关（r=-0.494、-0.568，均P＜0.05）。

3　讨论

益生菌主要通过调节宿主体内的菌群平衡发挥增强机体免疫力和抗肿瘤作用［13-14］。体内益生菌减少与菌群失调可以导致机体免疫力下降［15-16］。乳酸菌具有革兰阳性、厌氧或兼性厌氧的生物学特性，所以大多数抗菌药都对其有抑制或杀灭作用［17-19］。

长期以来，中国是世界上抗菌药物滥用情况最严重的国家之一，在现实生活当中，一方面，患者无处方自行购买使用抗菌药物现象日益严重，而对滥用抗生素产生的危害却知之甚少；另一方面，医务人员由于利益驱动，经常超量、不规范使用抗菌药物。世界卫生组织资料显示，我国住院患者抗菌药物的实际使用率高达80%，其中使用广谱抗菌药物和联合使用两种以上抗菌药物的占58%，远远高于30%这一国际水平，而在英美发达国家的使用率仅为22%～25%。另据不完全统计，目前我国使用量、销售量列在前15位的药品中，有10种是抗菌药物，而且我国住院患者抗菌药物的费用占总费用的50%以上，远高于国外的水平（15%～30%）［20］。在我国，超范围、无针对性地使用抗生素的现象越来越普遍。

本研究结果提示，在一定时间段内，抗菌药物累积使用达到一定量后，抗菌药物对肠道益生菌的杀灭作用存在剂量相关性，抗菌药物累积使用量越大，杀灭作用越明显；提示抗菌药物不合理使用杀灭了肠道益生菌，破坏了肠道正常的菌群平衡，引起淋巴细胞等免疫细胞活性下降，导致机体免疫力下降，使肿瘤发生成为可能。

本课题研究的意义在于警示抗菌药物不合理使用杀灭了肠道益生菌，破坏了肠道正常的菌群平衡，肠道菌群失调，引起肠道消化功能障碍、机体免疫力下降及诱发肿瘤发生、发展、形成；通过合理使用抗菌药物，可以保护机体益生菌及淋巴细胞等免疫细胞活性，维护机体正常免疫细胞功能，在一定程度上降低肿瘤发生的风险。

本研究是以抗菌药物使用为研究因素的单因素研究，通过合理设计处理，降低了混杂因素的影响，但由于本研究为小样本量的回顾性研究，故其可靠性有待进一步的大样本研究来证实。

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Study on the correlation between the activity of probiotic and antibiotics use in the patients with malignant tumor

ZHANG Hongxu1,2HAN Feng2HUANG Jinyue2LING Xin2LIU Guangfeng3WANG Yan1
1.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu Province，Xuzhou221002，China；2.Department of Pharmacy，Xuzhou Tumor Hospital，Jiangsu Province，Xuzhou221005，China；3.Department of Clinical Laboratory，Xuzhou Tumor Hospital，Jiangsu Province，Xuzhou221005，China

R733

A

1673-7210（2016）05（b）-0129-04

江苏省徐州市社会发展科技计划项目（XZZDY 1405）。

张红旭（1980-），男，硕士研究生，副主任药师；研究方向：医院药学。

王艳（1970-），女，副教授，主任药师，硕士研究生导师；研究方向：临床药学。

2016-01-22本文编辑：张瑜杰）