谭宏伟 楚光华 胡春艳 张恩娣西北妇女儿童医院妇科,陕西西安 710061
三七总皂苷对子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖、侵袭和凋亡的影响
谭宏伟楚光华胡春艳张恩娣
西北妇女儿童医院妇科,陕西西安710061
目的 探讨三七总皂苷(PNS)对子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其作用机制。方法 应用不同浓度的PNS分别作用于Ishikawa和HEC-1A细胞24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖率;Transwell检测细胞侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;采用RT-PCR和Western blot分别检测VEGF、PI3K、AKT的mRNA和蛋白表达水平。 结果PNS可以显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖。与control组比较,PNS处理的Ishikawa和HEC-1A细胞侵袭显著下降(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05),VEGF和PI3K的表达水平下降(P<0.05)。结论PNS能够抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖和侵袭,诱导细胞凋亡,其过程可能与VEGF/PI3K/AKT信号通路的抑制有关。
三七总皂苷;子宫内膜癌;血管内皮生长因子;PI3K/AKT信号通路
[Abstract]Objective To investigate the effects of Panaxnotoginsengsaponins(PNS)on the cell proliferation,invasion and apoptosis in endometrial cancercell line Ishikawa and HEC-1A and its underlying mechanism.Methods Ishikawa and HEC-1A cells were treated with different density of PNS for 24,48,72 h.The MTT method was used to detect the cell proliferation rate after Ishikawa and HEC-1A;cell invasion ability was detected by Transwell method;cell apoptosis was measured by flow cytometry;the mRNA and protein expression level of VEGF,PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Results PNS could significantly inhibited the cell proliferation of Ishikawa and HEC-1A cells.Compared with control group,the cell invasion ability of Ishikawa and HEC-1A apparently decreased(P<0.05),and the cell apoptosis were elevated with PNS treatment(P<0.05),the expression of VEGF and PI3K decreased with PNS treatment(P<0.05).Conclusion PNS inhibits the proliferation,invasion and induces apoptosis in Ishikawaand HEC-1A cells,which may be related to the inhibition of VEGF/PI3K/AKT signaling pathway.
[Key words]Panaxnotoginsengsaponins;Endometrial cancer;Vascular endothelial growth factor;PI3K/AKT
子宫内膜癌是三大妇科恶性肿瘤之一[1-2]。目前子宫内膜癌的治疗方法较多,以手术和放疗为主,辅助化学治疗或激素治疗,然而化学及激素治疗存在明显的复发症和毒副作用[3-4]。因此,寻找高效、安全、使用范围广的子宫内膜癌治疗新药是现今的研究热点。三七总皂苷(panaxnotoginsengsaponins,PNS)三七的主要有效成分,具有扩张血管、降低血脂和抗炎等药理作用[5-6]。已有研究表明,PNS对多种癌细胞的增值、凋亡和代谢等有影响[7-10]。但PNS在子宫内膜癌中的作用还未见报道。本研究拟以子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞系为细胞模型,探讨PNS对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并探讨其分子机制,为PNS治疗子宫内膜癌的临床应用提供理论依据。
1.1细胞培养
Ishikawa和HEC-1A细胞(American Type Culture Collection,ATCC)用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
1.2MTT法检测细胞增殖率
细胞以6×104个/孔接种置96孔板,应用不同浓度的PNS(50、100、150、200 μg/mL)(西安飞达生物公司)分别作用于Ishikawa和HEC-1A细胞24、48、72 h。弃去原培养液,每孔加入MTT(5 g/L)20 μL,37℃培养4 h。弃上清,每孔加入150 μL二甲基亚砜,振荡10 min使结晶充分溶解,于酶标仪上检测各组细胞吸光度值(A490),细胞增殖率=处理组A490/对照组A490×100%。
1.3Transwell法检测细胞侵袭
以正常培养的子宫内膜癌细胞为对照,以200μg/mL 的PNS处理的细胞为实验组。在Transwell上室聚碳酸酯膜上涂70 μL 1 mg/mL的matrigel胶,在37℃下静置60 min使其在微孔滤膜上重组为基底膜。胰酶消化待测细胞,收集细胞悬液后在离心半径为10 cm的离心机中1000 r/min离心5 min。重悬细胞后接种于Transwell上室内,并于下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液500 μL,孵育24 h。随后将滤膜上层的细胞用棉签抹去,用甲醇固定滤膜,Giemsa染色15 min。于200倍光镜下计算迁移到下层的细胞数量。
1.4流式细胞仪检测细胞凋亡
将待测细胞以2×105/孔的密度接种置6孔板,消化细胞,离心后弃去上清液收集细胞。PBS洗涤后离心弃上清液收集细胞,每孔加入100 μL结合缓冲液缓慢吹打,在悬浮细胞中分别加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI进行染色,摇匀后置于闭光孵育15 min。每管再加入400 μL结合缓冲液,于1 h内用流式细胞仪检测。
1.5RT-PCR检测mRNA表达
Trizol法提取待测细胞的总RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度,逆转录成cDNA后PCR扩增。取5 μL扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,自动凝胶成像分析仪分析。实验结果以目的基因灰度值/内参灰度值表示。
1.6Western blot检测蛋白的表达
细胞用0.05%胰蛋白酶消化后,PBS洗涤3次。加入65 μL RIPA细胞蛋白裂解液裂解细胞,随后进行SDS-PAGE蛋白电泳分离蛋白。电转膜后用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h,加入相应蛋白鼠抗一抗(Pierce,Rockford,USA),4℃轻摇过夜。随后加入HRP标记的羊抗鼠二抗,室温孵育1 h。最后用X线胶片曝光分析,结果用Image-Pro Plus处理。蛋白的相对表达量以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示。
1.7统计学方法
采用GraphPad Prism 5.0进行统计分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1PNS抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的生长
PNS能显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖,同一浓度下,随着PNS作用时间的延长细胞的增殖抑制率亦明显升高(P<0.05);并且随着PNS浓度增加,增殖抑制率明显升高(P<0.05)。后续实验采用200μg/mL PNS处理进行。见图1。
图1 三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞增殖的影响
2.2PNS抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的侵袭
经 200 μg/mL PNS处理 48 h后,Ishikawa和HEC-1A细胞的侵袭显著降低(P<0.05)。见图2。
图2 三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞侵袭能力的影响
2.3PNS诱导子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的凋亡
PNS处理48 h后,Ishikawa细胞的凋亡率升高至21.0%,HEC-1A的凋亡率升高至20.2%,与control比较,细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)。见图3。
2.4PNS抑制VEGF的mRNA和蛋白表达
分别检测Ishikawa和HEC-1A细胞中VEGF的mRNA和蛋白。与control比较,PNS组的VEGF mRNA和蛋白表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。
图3 三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞凋亡的影响
图4 三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞中VEGF mRNA和蛋白表达的影响
2.5PNS抑制PI3K/AKT信号通路蛋白表达
与control比较,p-AKT的mRNA、蛋白表达水平在PNS组中显著降低 (P<0.05),AKT的mRNA、蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。如图5所示,
图5 三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响
现今全球每年新发子宫内膜癌约14万例,死亡人数约4万人/年[11]。中药因其较高的安全性在癌症的治疗中起重要作用[12]。PNS影响女性生殖恶性肿瘤细胞的增殖及凋亡[7,13-14]。但目前关于PNS对子宫内膜癌的作用还未见报道。本研究发现,PNS能显著抑制体外培养的子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖和侵袭,促进其凋亡,提示PNS对子宫内膜癌可能具有一定治疗作用。
目前中药抗子宫内膜癌的研究主要从抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤侵袭等方面展开。Wang等[7]研究证明PNS对乳腺癌细胞的侵袭和转移能力有抑制作用。Wang等[15]研究表明,PNS可以通过降低结直肠细胞的增殖,诱导细胞凋亡。本研究结果表明,PNS能显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖,并且其抑制作用具有浓度、时间的依赖性,随着PNS浓度的增加和作用时间的延长,细胞的增殖抑制也明显增高。并且PNS可以有效抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的侵袭能力,对细胞的凋亡也有一定促进作用。以上结果表明,PNS能够抑制子宫内膜癌细胞的生长和侵袭,并诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。
近年来大量研究表明,VEGF是作用最强、特异性最高的调控因子,在肿瘤血管生成的各个环节中起到重要作用[16-17]。抑制VEGF可以达到抑制肿瘤血管新生并阻止肿瘤生长转移的目的[18]。已有研究表明PNS可以通过降低VEGF的表达降低动脉粥样硬化的血管新生[16]。本研究结果表明在PNS处理Ishikawa 和HEC-1A细胞中,VEGF的表达显著下降,提示PNS可能通过抑制VEGF影响子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和凋亡。
PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号转到通路之一,其异常激活与妇科肿瘤的发生、发展和转移等密切相关[19]。研究表明VEGF可以通过激活PI3K/ AKT信号通路促进子宫内膜癌细胞的增生及转移[20]。本研究结果发现PNS处理抑制PI3K/AKT信号通路在的Ishikawa和HEC-1A中的表达,与VEGF的表达趋势一致,说明PNS可能通过抑制子宫内膜癌细胞VEGF的表达,遏制PI3K/AKT信号通路激活。
综上所述,本研究表明PNS能够抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的增殖和侵袭,并促进细胞的凋亡,其过程可能与VEGF/PI3K/AKT信号通路的抑制有关。在以后的研究中应进一步对PNS在子宫内膜癌中的作用机制进行深入研究,为提高患者的治愈率和生存率,开发临床有效新型治疗药物提供思路。
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Effects of Panaxnotoginsengsaponins on proliferation,invasion,apoptosis of endometrial cancercell lines Ishikawa and HEC-1A
TAN HongweiCHU GuanghuaHU ChunyanZHANG Endi
Department of Gynaecology,Northwest Women and Children Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710061,China
R737.33
A
1673-7210(2016)05(b)-0013-04
谭宏伟(1971-),男,硕士,副主任医师;研究方向:妇科肿瘤以及妇科腹腔镜微创技术。
张恩娣(1953-),女,主任医师;研究方向:妇科肿瘤。
2016-02-15本文编辑:苏畅)