JAK1/TYK2- STAT-1/2信号通路对手足口病脑炎的诊疗价值

陈洁 温正旺 陈晓晴 金龙腾 陈益平 李昌崇

JAK1/TYK2- STAT-1/2信号通路对手足口病脑炎的诊疗价值

陈洁 温正旺 陈晓晴 金龙腾 陈益平 李昌崇

目的 探讨干扰素JAK1/TYK2- STAT-1/2信号通路在EV71手足口病脑炎中的诊疗价值。方法 选取2014年1月至2015年1月手足口病患儿144例为观察组，分成4组，手足口病儿童2d组（A组）、手足口病儿童5d组（B组）、手足口病脑炎2d组（C组）、手足口病脑炎5d（D组）组，另选择正常体检儿童为对照组，每组各36例，用ELISA法检测患儿血液中JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白及干扰素的表达水平。结果 观察组干扰素的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），B组明显高于D组及A组（P＜0.01）；观察组JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），B组高于D组及A组（P＜0.01）。结论 手足口病脑炎患儿干扰素及JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表达水平与正常儿童比较明显升高，但与普通手足口病患儿比较降低，提示JAK1/TYK2-STAT-1/2信号通路对手足口病脑炎具有一定的诊断意义。

EV71 手足口病 脑炎 干扰素

手足口病是一种较为严重的传染性疾病，严重者可并发手足口病脑炎，好发于学龄前儿童，多数症状在未经药物治疗的情况下3～6d好转［1］。研究认为EV71导致手足口病脑炎＞50%［2］。干扰素可以影响EV71手足口病脑炎的进展及预后，其在体内主要包括产生和应答机制，本文探讨干扰素JAK1/TYK2-STAT-1/2信号通路对EV71手足口病脑炎的影响，为手足口病脑炎诊疗及研究提供一个新的靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2014年1月至2015年1月本院手足口病患儿144例为观察组，男72例，女72例，年龄6个月至3岁。均经脑脊液、粪便EV71检查及临床表现确诊，排除合并其它疾病。依据病情及时间分成4组，手足口病患儿2d组（A组）、5d组（B组）；手足口病脑炎患儿2d组（C组）、5d组（D组），每组各36例。另选择同期健康体检儿童36例为对照组，男18例，女18例；年龄6个月至3岁。各组一般资料比较差异无统计学意义。

1.2 方法 采用ELISA法检测各组中JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2及干扰素的蛋白表达（试剂盒由博士得公司提供），每日清晨抽取各组的外周静脉血1.5 ml，共5组，加入 24孔培养板中，每孔加入40μl血，第1 孔加入生理盐水作为基础对照，第2、3、4、5、6 孔作阳性对照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔分别用生理盐水稀释成 50g/ml，加入总量均为200μl，加入抗原后轻微摇动20s，37 ℃水浴中孵育时16～20h，抽取血浆上清液适量，于-20 ℃冰箱冷冻备用，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。干扰素的释放水平检测严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件。正态计量资料以（±s）表示，正态分布资料采用one-way ANOVA方差分析，组间比较方差齐采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane's T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组干扰素的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），B组明显高于D组及A组（P＜0.01）；观察组JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表达水平明显高于对照组（P＜0.01），B组高于D组及A组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组相关指标比较（±s）

表1 各组相关指标比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与A组比较，#P＜0.01；与D组比较，△P＜0.01

组别JAK1TYK2STAT1STAT2干扰素A 组1.98±0.07*3.47±0.09*2.47±0.08*2.01±0.07*2.76±0.07* B组3.93±0.13*#△4.75±0.11*#△3.64±0.11*#△3.41±0.13*#△3.78±0.011*#△C组1.85±0.08*3.35±0.13*2.39±0.07*1.96±0.07*2.60±0.07* D组2.25±0.15*3.77±0.17*2.53±0.14*2.11±0.10*2.77±0.012*对照组1.20±0.092.23±0.061.58±0.091.38±0.061.55±0.04 F值267.16122.94115.61312.14133.05 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 讨论

手足口病是一种严重的传染性疾病，多发生于＜5岁儿童，患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前仍缺乏有效治疗药物，主要对症治疗。手足口病脑炎的病理生理机制目前尚未完全明确，据流行病学调查，EV71病毒是致手足口病脑炎最常见的一种病毒，绝大多数的手足口病脑炎多由EV71病毒感染引起，但目前对EV71病毒的检测及EV71病毒感染的治疗存在滞后性及缺乏针对性，目前研究发现EV71病毒感染所致手足口病脑炎可导致脑干脑炎以及严重的神经系统损伤。

干扰素作为一种应用广泛的抗病毒药物，在EV71脑炎的治疗中引起关注。干扰素是一类高活性多功能的糖蛋白，能诱导细胞对病毒感染产生抗性，其通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品［3］。其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，作为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒均有抑制作用。崔雨［4］研究认为，当机体感染病毒时会分泌干扰素产生抗病毒作用，当感染EV71病毒时，则会抑制干扰素的分泌。 在临床治疗中使用干扰素制剂可以对EV71手足口病脑炎的症状起到控制作用［5］。本资料中EV71手足口病脑炎患儿的干扰素水平明显高于正常儿童，提示干扰素与EV71手足口病脑炎存在重要联系。

干扰素主要通过其应答信号通路发挥作用。干扰素的应答通路，通常指经典的Janus激酶-信号转导子与转录激活子（JAK-STAT）信号通路，在抗病毒方面具有重要作用。在这条通路中JAK和STAT蛋白的表达最为重要。大多数白介素（ILs）、细胞集落刺激因子（CSFs）和干扰素（IFNs）等细胞因子均通过JAK/STAT信号通路发挥作用，提示JAK/STAT信号通路参与细胞内多种生物学活动。有研究提示干扰素的应答通路中，主要有JAK1、TYK2、STATI和STAT2参与。

酪氨酸激酶2（TYK2）是JAK（Januskinase）信号传导家族的成员之一，IL-12和IFN信号途径均需要的一种酶，是IFN、IL-6、IL-10、lL-12和IL-13信号传导的重要分子；TYK2功能缺失会导致多种细胞因子信号通路发生缺陷。TYK2在免疫系统的抗病毒及肿瘤监测中具有关键作用，与多种细胞因子受体链相联，包括干扰素受体，白细胞介素受体。目前已成功建立TYK2基因调控位点大鼠模型，证实TYK2在大鼠模型中具有抗病毒作用。在TYK2基因敲除（TYk2-）小鼠模型中，机体的免疫系统产生损伤作用，例如T淋巴细胞和树突状细胞会出现失功能状态，引起的NK细胞和CD4+T细胞的反应缺乏，对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒导致的CD8+CTL反应减弱，硕大利什曼原虫感染后，IL-12引起的CD8+T细胞IFN的产生出现强烈抑制，急性细胞内感染的李斯特菌CD8+Tcl的IFN产生明显减少，提示TYk2在IL-12通过其受体激活NK细胞、CIM+T细胞和CD8+T细胞的信号传导中起重要作用［6］。本资料中发现手足口病及并发脑炎患儿，TYK2随着发病时间出现不同程度的升高，这些均与干扰素的产生及功能表达相关，提示TYK2在干扰素的信号系统中具有重要作用。

干扰素首先与细胞膜上的受体IFNARl和IFNAR2结合，随后激活与之偶联的Janus激酶家族的Jakl和TYk2，Jakl和TYk2的磷酸化使得下游的信号转导与转录激活因子1和2（STAT1，STAT2）发生磷酸化而活化，磷酸化的STATl和STAT2与干扰素反应因子9（IRF9）形成转录因子复合物干扰素刺激基因因子3 （ISGF3）［7］。ISGF3转位到核内与干扰素刺激调节基元（ISRE）结合引发下游抗病毒蛋白的转录和翻译，从而发挥干扰素的抗病毒作用［8］。

JAT/stat信号通路在抗病毒中的作用极为常见，其在抗病毒免疫系统中具有重要作用，在多个干扰素相关的抗病毒过程中均检测到通路信号分子蛋白表达的改变。研究提示在儿童最常见的呼吸道合胞病毒感染中，呼吸道合胞病毒会抑制干扰素介导的抗病毒反应，最常见的是抑制STAT1和STAT2的蛋白表达，最终导致ISGF3和IRF9表达的下降［9］。在丙肝患者的免疫细胞中，STAT蛋白的表达出现明显下降，与肝脏细胞中HCV的表达正好相反，然而STAT mRNA的表达却呈正常值，未出现波动，机制分析揭示，当HCV感染时，STAT蛋白优先出现泛素化，其降解过程却会被蛋白酶体相关的抑制物MG132阻止，这些提示HCV感染涉及的干扰素信号通路激活过程中，JAK/STAT通路作用较为明显［10］；本资料显示在EV71手足口病及并发脑炎的患儿中JAK/STAT通路的表达水平明显升高，存在时间依赖性，值得注意的是在手足口病脑炎患儿中，该通路的表达水平并未随发病时间的延长而升高，提示EV71病毒感染对该通路具有抑制作用，与以往的研究一致，提示JAK/STAT通路参与EV71手足口病脑炎的发生发展过程。

据此作者推测干扰素JAK1/TYK2-STAT-1/2信号通路可能在EV71中枢神经系统损伤中发挥重要作用且具有一定的诊疗意义。但本课题由于其局限性，未设置通路抑制剂组进行比较，无法全面了解该信号通路在手足口病脑炎中的作用，后续将通过动物实验来进一步验证。

1 Lin Y L， Yu C I， Hu Y C， et al. Enterovirus type 71 neutralizing antibodies in the serum of macaque monkeys immunized with EV71 virus-like particles. Vaccine，2012，30（7）：1305～1312.

2 李洁， 曲梅， 贾蕾， 北京市2010年手足口重症病例EV71检出情况及病原学分析.中华流行病学杂志，2012，33（9）：926～929.

3 Huang T S， Shyu Y C， Chen H Y， et al. A systematic review and meta-analysis of adjuvant interferon therapy after curative treatment for patients with viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. J Viral Hepat，2013，20（10）：729～743.

4 崔雨，宋佳， 肠道病毒71型抵抗Ⅰ型干扰素诱导的抗病毒作用. 中华实验和临床病毒学杂志，2012，26（2）：102～104.

5 陈聪，余春梅，王晓宇.重组人干扰素α1b雾化治疗121例手足口病疗效分析. 检验医学与临床，2014（09）：1233～1234.

6 Vielnascher R M， Hainzl E， Leitner N R， et al. Conditional ablation of TYK2 in immunity to viral infection and tumor surveillance. Transgenic Res，2014，23（3）：519～529.

7 Nadeau O W， Domanski P， Usacheva A， et al. The proximal tyrosines of the cytoplasmic domain of the beta chain of the type I interferon receptor are essential for signal transducer and activator of transcription （Stat） 2 activation. Evidence that two Stat2 sites are required to reach a threshold of interferon alpha-induced Stat2 tyrosine phosphorylation that allows normal formation of interferon-stimulated gene factor 3. J Biol Chem，1999，274（7）：4045～4052.

8 Zhao H， Boije H， Granberg F， et al. Activation of the interferoninduced STAT pathway during an adenovirus type 12 infection. Virology，2009，392（2）：186～195.

9 Wang R， Nan Y， Yu Y， et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Nsp1beta inhibits interferon-activated JAK/STAT signal transduction by inducing karyopherin-alpha1 degradation. J Virol，2013，87（9）：5219～5228.

10 Stevenson N J， Bourke N M， Ryan E J， et al. Hepatitis C virus targets the interferon-alpha JAK/STAT pathway by promoting proteasomal degradation in immune cells and hepatocytes. FEBS Lett，2013，587（10）：1571～1578.

Objective To investigate the role of JAK1/TYK2-STAT-1/2 signal pathway in the diagnosis of EV71-induced encephalitis of hand food and mouth disease. Methods The study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There were 180 members and they divided into fi ve groups，each group includes 36. 2 day control group（2C），2 day hand-food-mouth（2h），5 day hand-food-mouth（5h），2 day hand-food-mouth and encephalitis（2e），5day hand-food-mouth and encephalitis（5e）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood. Results Elisa assay：the levels of interferon，JAK1，TYK2，STAT-1，STAT-2 protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups，（P<0.01），especially the 5h group，there was no signifi cant difference found between 2e group and 2h group，it was the same between 2e and 5e group. Conclusions The levels of the levels of interferon，JAK1，TYK2，STAT-1，STAT-2 protein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but were expressed less than that groups of general hand food mouth disease，which suggest that JAK1/TYK2-- STAT-1/2 signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省温州市科技局项目（Y20140500）

325000 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院感染科