响应面法优化杨树花多糖超声提取工艺

焉　鑫,王碧莹,赵家洪,陈雪英,陈俭清,盛尊来

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨 150030)



响应面法优化杨树花多糖超声提取工艺

焉鑫,王碧莹,赵家洪,陈雪英,陈俭清,盛尊来*

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨 150030)

采用Plackett-Burman设计结合Box-behnken响应面法优化杨树花多糖的超声提取工艺。以杨树花多糖得率为考察指标,对影响杨树花得率的超声功率、超声频率、提取温度、提取时间、提取次数、液料比、颗粒大小、醇沉时间、醇沉浓度等9个因素,采用Plackett-Burman设计从中筛选出具有显著效应的因素-超声功率、提取温度、提取时间;进一步以杨树花多糖得率为考察指标,采用Box-behnken设计响应面法对以上三个因素进行考察,确定最佳工艺条件为:超声功率195 W,提取温度66℃,提取时间43 min,以此条件提取的多糖含量为63.18±1.57mg/g,与理论预测值仅相差2%～3%。

杨树花,多糖,超声提取,Plackett-Burman设计,Box-behnken设计

杨树花(Flos populi)为杨柳科(Salicaceae)植物毛白杨(Populus tomentosa)、加拿大杨(Populus canadensis)、或同属植物的干燥雄花序,味苦性寒,具有清热解毒,化湿止痢之功效,为《中华人民共和国兽药典》2010版所收载[1]。杨树花含有丰富的黄酮及多糖类化合物,目前,对其总黄酮的研究已有较多报道[2-3],但至今对杨树花多糖的研究较少,尤其缺乏系统的杨树花多糖提取工艺的研究以及生物活性评价。而大量药理及临床研究证实,植物多糖具有增强免疫力、抗氧化、控制血糖、降胆固醇、降血脂等广泛的生物活性[4-6],作为食品、饲料添加剂等方面具有广阔的前景[7],因此对杨树花多糖提取工艺进行优化具有十分重要的意义。

目前,提取植物多糖的方法有热水浸提法、酸碱溶液提取法、微波提取法、超声提取法等多种方法[8-9],其中超声提取法操作简单,并且可以在较低温度、较短时间下获得较高的得率[10],已被开发运用在多种植物活性成分的提取中。超声提取法需考察的影响因素较多,而Plackett Burman设计结合响应面法可确定影响得率的关键因素[11],并对其进行优化。因此,本文在单因素实验基础上,采用Plackett Burman设计筛选出影响杨树花多糖得率的主要因素,进一步采用Box-behnken design响应面法对其进行优化,确定最佳工艺参数。

表1　单因素实验设计

1　材料与方法

1.1材料与仪器

杨树花采摘于东北农业大学院内,采收期为2013年9月,经黑龙江中医药大学李彦冰教授鉴定为杨柳科植物毛白杨的雄花序;D-无水葡萄糖(No.1108332200503)中国药品生物制品鉴定所;蒽酮(分析纯)上海科峰生物技术有限公司;95%乙醇、硫代巴比土酸、三氯化铁、脱氧核糖、乙二胺四乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、双氧水、氯仿、正丁醇、浓硫酸、标准葡萄糖等(均为分析纯)杭州化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH)、抗坏血酸西格玛化学试剂公司;所用水为去离子水。

UV-8000A紫外分光光度计上海市元析仪器有限公司;DH6000A电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司;DHG-9070型热恒温鼓风干燥箱上海恒科学仪器有限公司;S224分析天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。KQ-300VDE三频数控超声清洗器昆山市超声仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器上海亚荣生物化学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的制备及含量测定采用蒽酮-硫酸法[12],取葡萄糖对照品配成100 μg/mL的溶液,分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL溶液置于干燥试管中,加蒸馏水至2 mL,于冰水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL,100℃水浴反应10 min,冷却至室温后,静置20 min,于620 nm下测定吸光度。

精密称取多糖0.1 g,以水溶解并定容至100 mL,精密量取2 mL并定容至10 mL得到杨树花多糖样品溶液,精密量取样品溶液1.0 mL置于10 mL具塞试管中,加蒸馏水至2 mL,于冰水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL,100℃水浴反应10 min,冷却至室温后,静置20 min,于620 nm下测定吸光度A,代入回归方程计算多糖的浓度,每组实验做3次平行。

1.2.2超声波提取的工艺流程称取杨树花粉→按料液比加水配液→超声提取→离心分离(3000 r/min,5 min),取上清液→加乙醇,于4℃静止→离心分离(3000 r/min,5 min)→多糖沉淀。

1.2.3杨树花多糖提取条件单因素实验准确称取杨树花粉末0.5 g,按照表1的方案分别对各参数进行考察,并依据公式(1)分别测定其在不同功率时多糖的得率(以每克原料药中含有多糖的毫克数计),确定各因素的中心点。

式(1)

1.2.4响应曲面法实验设计在Plackett Burman实验结果基础上,采用Box-Behnken设计进行实验,利用Design-expert 8.0软件对实验结果进行分析,优化出最佳提取工艺,并对该工艺进行验证。实验因子和水平表见表2和表3。

表2　Plackett Burman实验分析因子及水平表

表3　Box-Behnken实验分析因子及水平表

1.3数据统计分析

Plackett Burman及Box-Behnken实验所测得数据,均经Design-expert 8.0软件进行方差分析(F检验),以分析各因素对得率的影响。

2　结果与讨论

2.1单因素实验提取条件选择

图1　各单因素对杨树花多糖得率的影响Fig.1　Effect of different parameters on extraction yield of Polysaccharide from the Flos Populi注:超声功率(A)、超声频率(B)、粒径大小(C)、提取温度(D)、提取时间(E)、 液料比(F)、提取次数(G)、醇沉浓度(H)、醇沉时间(I)。

各因素对杨树花多糖得率影响的结果如图1所示。由图1A可知,随着超声功率的增大,多糖得率先上升后下降,并在180 W时出现最高点。这是因为功率加大可加大细胞的破碎程度,有利于成分的溶出[13],但功率过大可使更多脂溶性成分溶解而影响多糖的得率。由图1B可知,与超声功率相比,超声频率对杨树花多糖得率的影响较小(51.6～56.5mg/g),所以在45 kHz下的超声频率足以获得良好的得率。图1C表明随着粒径变小,多糖得率先上升后下降,并在24目时出现最高点。这是因为粒径越大与溶剂接触面积越大,所以先随粒径的变小得率增高[14];但如药粉过细,药粉本身会对成分产生吸附,反而影响了成分的溶出。提取温度对杨树花多糖得率的影响见图1D,在较低提取温度下,杨树花多糖得率仍较高。随着提取温度升高,多糖提取得率逐渐上升,直到60℃时达到最高点,然后有所下降。这主要是由于温度升高使多糖的溶解度增加,并且扩散系数增加,促进提取速度加快[15]。然而温度过高,一些多糖类化合物被破坏,使得率反而降低。提取时间对杨树花多糖得率的影响见图1E,杨树花多糖得率随着提取时间的延长而增大,在40 min时达到最大值,继续延长时间得率变化不大。这说明40 min时已达到溶解平衡。液料比对杨树花多糖得率的影响见图1F,随着液料比的增加,杨树花多糖的得率也在增加,但由曲线的斜率可知,液料比从25 mL/g增加到35 mL/g时,得率变化不大,为节省溶剂选取25 mL/g液料比进行提取。提取次数对杨树花多糖得率的影响(图1G),前三次提取,多糖的得率增加较大(斜率较陡),而3～5次不同提取次数所获多糖产率相差不大(斜率较缓),说明前三次已能较完全的将多糖从杨树花药材溶出。醇沉浓度对杨树花多糖得率的影响(图1H),增加醇沉浓度可增加多糖得率,但乙醇浓度达到80%以上时,多糖得率变化不大,并且过高的醇沉浓度会导致杂质的增多,因此醇沉浓度80%时,比较适合获取杨树花多糖。醇沉时间对杨树花多糖得率的影响(图I),醇沉24 h较醇沉12 h所得多糖产率提高了近16%,而继续延长醇沉时间,多糖得率变化不大,说明24 h能够使多糖得以充分的沉淀。

表4　Plackett-Burman实验设计及响应值

2.2Plackett-Buman实验设计筛选关键因素

在单因素实验基础上,确定了Plackett-Buman实验设计的各个因素和水平,Plackett-Buman实验设计及响应值见表4,结果利用Design-expert 8.0软件进行方差分析,确定关键因素,结果见表5。

表5　各个因素的显著性检查

注:*表示p<0.05,**表示p<0.01。

由表5可以看出,超声功率(p<0.05)、提取温度(p<0.01)、提取时间(p<0.01)对得率具有显著影响。

因此,在下一步采用Box-Behnken响应面设计对其进一步优化。对于不显著因素,根据单因素实验结果选取各因素的中心点进行实验,即依据单因素考察结果,选取超声频率45 kHz,粒径大小24目,液料比30 mL/g,提取次数3次,醇沉浓度80%,醇沉时间24 h。

2.3Box-Behnken设计进一步优化关键因素

表7　响应面回归模型ANOVA分析结果

通过对实验数据进行多重回归分析,响应值和实验的变量关系遵守以下二阶多项式方程:

Y=-454.54121+2.00586X1+6.83530X2+4.33832X3+8.26923E-003X1X2-4.53294-003X1X3-0.017527X2X3-6.02869E-003X12-0.057857X22-0.026429X32

X1,X2,X3分别代表超声功率、提取温度和提取时间。上述回归方程的方差分析结果见表7。

表6　杨树花多糖得率响应面方案及结果

从各个因素的显著性水平差异可知,对杨树花得率的影响次序为:提取温度X2>超声功率X1>提取时间X3。并且交互项X1X2及二次项X12、X22、X32均对多糖得率具有显著的影响。

2.3.2响应面分析用Design-Expert.8.0绘制杨树花多糖提取各个影响参数的响应面,三维的响应面图和二维的等高线图(响应面水平方向的投影)的结果见图2,同时各个影响参数的相互作用也反映在图中,交互作用的强弱可以从等高线的形状中反映出来,其中,椭圆形代表两个因素交互作用较强,圆形则较弱[16]。从图2可以看出,提取温度、超声功率的交互作用较明显(二维等高线图为椭圆形),当超声功率较低时,得率随温度的变化并不明显;当超声功率较高时,得率随着温度的提高而显著提高,说明适当的提高温度与功率有利于杨树花多糖的提取。

图2　超声功率(X1)和提取温度(X2)对得率的响应面分析Fig.2　RSM analysis for interactive effects of ultrasonic power(X1)and extraction temperature(X2)

2.3.3最佳工艺确定及验证将表3数据经Design-Expert 8.0软件处理,得到杨树花多糖的最佳提取条件为:超声功率为195.7 W、提取温度为66.5℃、提取时间为43.3 min。考虑到实验的可操作性,将其调整为超声功率195 W、提取温度66℃、提取时间43 min。在此条件下,多糖的得率为63.18±1.57mg/g(N=3),与理论预测值仅相差2%～3%(预测值62.84mg/g),说明优化的模型可靠。

3　结论

单因素实验最优值结果如下:超声功率180 W、超声频率45 kHz、粒径大小24目、提取温度60℃、提取时间40 min、液料比25 mL/g、提取次数3次、醇沉浓度80%、醇沉时间24 h。

本研究的结果表明超声辅助提取杨树花多糖是一种有效、操作方便、可靠和可行的方法,其最佳提取工艺条件为超声功率195 W,提取温度66℃,提取时间43 min。在此条件下,杨树花多糖的得率为63.18±1.57mg/g(N=3),与预测值62.84mg/g相近,说明实验结果与模型符合性良好,所优化的工艺参数准确、可靠。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction(UAE)of polysaccharides from Flos Populi with response surface methodology

YAN Xin,WANG Bi-ying,ZHAO Jia-hong,CHEN Xue-ying,CHEN Jian-qing,SHENG Zun-lai*

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

To investigate and optimize the ultrasound-assisted extraction procedure for the water-soluble Polysaccharide from the Flos Populi,important variables and their levels were obtained using Plackett-Burman design and Box-Behnken design.A mathematical model was developed to show the effects of each variable and their combinatorial interactions on extraction yield of Polysaccharide.A high coefficient of determination(R2=98.77%)indicated good agreement between the experimental and predicted values of Polysaccharide yield.The optimum levels of these significant parameters were determined using response surface methodology(RSM),which revealed these as follows:ultrasonic output power 195 W,extraction temperature 66℃,extraction time 43 min.Under these conditions,63.18±1.57mg/g of polysaccharide was extracted,which had a difference of 2%～3% with the predicted value.

Flos Populi;polysaccharides;Ultrasound-assisted extraction;Plackett-Burman design;Box-Behnken design

2015-09-17

焉鑫(1992-)，男，硕士，研究方向：天然药物化学，E-mail:Elijahy92@163.com。

盛尊来(1979-)，男，博士，副教授，主要从事天然产物分析方面的研究，E-mail:shengzunlai@neau.edu.cn。

国宝自然科学基金(31201944)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)07-0164-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.024