坛紫菜木瓜蛋白酶水解肽的抗肿瘤活性研究

白　露,范晓丹,张学武

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)



坛紫菜木瓜蛋白酶水解肽的抗肿瘤活性研究

白露,范晓丹,张学武*

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

坛紫菜是一种重要的经济海藻,营养价值极高。为了探究坛紫菜中的抗肿瘤活性多肽,本研究以坛紫菜粉末为原料,采用反复冻融法和超声波破碎法相结合提取蛋白,使用木瓜蛋白酶对粗蛋白进行酶解。初酶解物在MTT细胞增殖检测结果的指引下,结合超滤、葡聚糖凝胶Sephadex G-15的分离纯化和MALDI-TOF质谱分析,最终筛选出具有较强抗肿瘤活性的多肽。结果显示经木瓜蛋白酶酶解物(设为P,分子量0～3 ku)分离纯化得到的多肽组份P2,包含5个多肽,对乳腺癌MCF-7和肝癌细胞HepG-2的IC50值分别是63.64 μg/mL和59.09 μg/mL,其抗肿瘤活性均显著高于阳性对照5-氟尿嘧啶(对MCF-7和HepG-2的IC50值分别是195.45 μg/mL和122.72 μg/mL),组份P3包含11个多肽,对肝癌细胞HepG-2的IC50值是209.09 μg/mL,也具有一定的选择性抑制作用。

坛紫菜,酶解,肽,抗肿瘤,活性

生物活性肽(Bioactivity peptides)又称功能肽(Functional peptides),是一类具有一定生理活性功能的肽,能抑制肿瘤细胞生长,破坏、杀伤肿瘤细胞或者抗菌、抗病毒、降血压、降血糖等重要作用[1-4]。由于其分子量小、易于吸收,可以广泛的应用于保健品和药物的开发,因此,生物活性肽已成为蛋白质研究的热点之一。

由于近几年来恶性肿瘤的发病率不断提高,而传统化疗药物不仅毒副作用大而且治疗效果并不理想,因此,生物活性肽凭借其活性高、副作用小、针对性强的优势得到了国内外科研工作者的研究和关注。目前已经从多种生物中提取得到了抗肿瘤活性肽,其中海洋生物来源的活性肽展现了广阔的前景。Golakoti T等从念珠藻(Nostocsp.)中提取得到的Cryptophycins多肽,对裸鼠异种移植的克隆癌、胰腺癌、乳癌和卵巢癌均具有很强的抑制作用。其中的Cryptophycins1和半合成的Cryptophycins8有较好的水溶性,并且对多种移植瘤包括多药物抗性细胞系均有较好的治疗效果,目前已进入临床实验阶段[5-6]。易杨华等从棕色扁海绵(PhakelliafuscaThiele)中分离到一个具有抗有丝分裂活性和抗肿瘤活性的环7肽化合物[7]。从海蛤蝓Elysia rufescens及其所食的海藻Bryopsissp.中分离出来的Kahalalide F是由13个氨基酸残基组成的环状缩酚酸肽,它对前列腺癌、乳腺癌、胸腺癌和非小细胞肺癌等都有较强的抗肿瘤活性,且对正常细胞的敏感度降低,目前已处于实体瘤治疗的Ⅱ期临床实验阶段[8]。

坛紫菜(Porphyrahaitanesis)富含丰富的蛋白质、多糖、维生素、脂质和矿物质等多种成分,其中蛋白质含量达30%[9-11],根据《本草纲目》记载,坛紫菜还具有清热解毒降血压、抗癌等功效。利用酶解手段将坛紫菜蛋白进行非变性水解,不仅能提高坛紫菜蛋白的溶解率和体内吸收利用率,还能获取具有特殊生理功能的生物活性肽。目前,已有报道从坛紫菜蛋白酶解物中成功提取出了ACE抑制肽、抗氧化肽、抑菌肽等[12-13],但抗肿瘤肽却处于初级阶段。本文对坛紫菜蛋白进行酶解、超滤、凝胶色谱分离和MALDI-TOF-TOF质谱分析等技术,并以MTT实验为活性指标,筛选具有抗肿瘤活性的多肽组份,为制备坛紫菜抗癌药物提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

坛紫菜广东汕头市南澳县金山农业发展有限公司;乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2中山大学动物细胞实验室;MTT美国Sigma公司;木瓜蛋白酶广州齐云生物科技有限公司;Sephadex G-15美国GE公司;高糖DMEM完全培养基,胎牛血清,青霉素,链霉素,PBS美国Gibco公司;胰蛋白酶-EDTA消化酶,DMSO美国Bio Basic Unit公司;5-氟尿嘧啶上海汉博生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

Allegra X-22R高速冷冻离心机美国Beckman Coulter公司;UV2300紫外分光光度计上海天美科学仪器有限公司;Savant Modulyod冷冻干燥器美国Thermo公司;SW-TJ 水平流净化工作台苏州市净化设备总厂;自动部分收集器上海嘉鹏科技有限公司;HL-2B 恒流泵上海精科实业有限公司;酶联免疫检测仪Sunrise 公司;MCO-17AC CO2培养箱，MDF-382E 超低温冰箱日本Sanyo公司;CK41倒置显微镜Olympus公司;超滤杯MS300、超滤膜上海摩速科学器材有限公司;LDZX-40BI 自动高压灭菌锅上海申安医疗器械厂;DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱上海益恒实验仪器有限公司;UItraFleXtreme基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪德国BRUKER公司。

1.2实验方法

1.2.1坛紫菜蛋白的提取反复冻融法提蛋白:准确称取20 g坛紫菜粉末,用PBS(pH 7.2～7.8)浸泡过夜,料液比1∶20(g/mL),在-20 ℃和室温下反复冻融6次。将获得的溶液于温度4 ℃,转速为8000 r/min下离心30 min,去除沉淀获得蛋白上清液,并迅速真空冷冻干燥。取一部分冻干的蛋白粉末采用Bio-Rad Protein Assay法测定蛋白质含量,其余放置-20 ℃冰箱中保存备用。整个实验过程要进行避光保护。

反复冻融结合超声波破碎法提蛋白:准确称取20 g坛紫菜粉末,用PBS(pH7.2～7.8)浸泡过夜,料液比1∶20(g/mL),在-20 ℃和室温下反复冻融6次,在此条件下,然后采用超声破碎法,在450 W的超声功率下每超声6 s间隔9 s,共超声100次将坛紫菜细胞壁破碎,使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性,将样品置于冰浴中。最后,将获得的溶液于温度4 ℃,转速为8000 r/min下离心30 min,去除沉淀获得蛋白上清液,并迅速真空冷冻干燥。取一部分冻干的蛋白粉末采用Bio-Rad Protein Assay法测定蛋白质含量,其余放置-20 ℃冰箱中保存备用。整个实验过程要进行避光保护。

蛋白质含量和蛋白质提取率计算公式:

蛋白质含量(%)=标准曲线上查得的浓度×初始蛋白溶液体积/样品重×100

式(1)

蛋白质提取率(%)=提取液中蛋白质含量/被提取坛紫菜中蛋白质含量×100

式(2)

1.2.2坛紫菜酶解物的制备称取6 g的粗蛋白,配制浓度为2%的坛紫菜蛋白溶液,调节酶解温度55 ℃、pH6.5、酶底比([E/S])4%[14-15]后,加入木瓜蛋白酶进行水解,实验过程中以0.1 mol/L NaOH和HCl随时控制体系pH,水解过程中pH控制在pH±0.05之内。水解8 h后,95 ℃水浴灭酶10 min,室温冷却后将水解液在8000 r/min下离心30 min,取部分上清液,采用甲醛滴定法[16]法测定水解度,其他部分迅速超滤。

1.2.3多肽的分离纯化

1.2.3.1超滤将得到的酶解液,分别用10、5、3 ku的超滤组件进行超滤,超滤压强小于0.25 MPa,进而得到10 ku以上,5～10,3～5 ku和3 ku以下四个分子量的组份,分别收集并迅速冷冻干燥[17]。

1.2.3.2凝胶层析层析柱填料是Sephadex G-15凝胶[18],柱体积180 mL,上样量150 mg,上样浓度50 mg/mL,流速0.35 mL/min,流动相为超纯水,使用自动分布收集器,每7 min收集一管。用紫外分光光度计分别在215 nm和280 nm下测定吸光度值,收集各组份冷冻干燥后备用。

1.2.4体外抗肿瘤实验使用MTT比色法[19]测定分离纯化后的多肽组份对人乳腺癌细胞(MCF-7)和人肝癌细胞(HepG-2)的抑制作用。选择活力较好的对数期细胞,加入胰酶消化,加入3 mL培养基制成细胞悬液。用血球计数板计数,调整细胞悬液浓度为5×104个/mL,接种于96孔板中,每孔加入100 μL细胞悬液,放置于37 ℃恒温培养箱中,培养24 h,待细胞贴壁,吸出细胞培养液,加入200 μL含有不同多肽浓度的DMEM培养液,阴性对照是DMEM,阳性对照是5-氟尿嘧啶,平行3次。放入37 ℃恒温培养基中,培养48 h,取出孔板,吸出药液,使用PBS洗板两次,每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL和DMEM培养液180 μL,放入培养箱继续培养4 h,吸出MTT溶液,每孔加入150 μL DMSO震荡15 min,在490 nm下测定OD值。

癌细胞生长抑制率(%)=(OD对照-OD空白)-(OD给药-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100

1.2.5MALDI-TOF质谱数据的分析用超纯水溶解多肽样品,使其浓度为1 mg/mL用于分析。取多肽液点AnchorChip靶,晾干,取基质点在晾干的样品上,再对应点上标准品后,使用MALDI-TOF质谱仪进行分析。质谱仪分析参数为:Smartbeam固体激光器,频率为1000 Hz,波长为355 nm;flexControl软件采集数据:反射模式,离子源加速电压1为25 kv,加速电压2为22.55 kv,离子延迟提取80 ns,并用标准品作为外标校正质谱峰,正离子谱测定,测定范围控制在700～3500,获得样品的肽质量指纹图谱,胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除。接着利用LIFT软件将选择的峰进行串级质谱分析。

1.2.6坛紫菜总氮含量的测定将坛紫菜饼打成粉末,过40目筛,取一定量的坛紫菜粉末,根据国标GB/T5009.5-2003,用凯氏定氮法测定坛紫菜粉末中的总氮含量。

1.2.7统计分析采用 SPSS 19.0软件进行分析统计,数据采用平均数±标准差(x±s)表示,进行t检验。IC50值采用Origin8.0软件中非线性拟合得出。

2　结果与讨论

2.1蛋白质提取率

通过凯氏定氮法测得坛紫菜蛋白质含量是29.37%,Bio-Rad Protein Assay方法测定提取的坛紫菜蛋白质含量的标准曲线如图1所示。

图1　蛋白质标准曲线Fig.1　The standard curve of Bio-Rad Protein Assay

测得蛋白质标准曲线为:Y=0.4302X+0.0177,R2=0.9946

经(1)、(2)公式计算,反复冻融法所得蛋白质提取率是25.58%,蛋白质含量是40.75%,反复冻融与超声破碎法所得蛋白质提取率是40.39%,蛋白质含量是48.66%。由此可见,反复冻融与超声波破碎相结合的方法蛋白提取率和蛋白质含量均大于单独使用反复冻融法,说明反复冻融结合超声波破碎法能使坛紫菜细胞破碎得更加彻底,释放出更多的蛋白质。

2.2超滤后所得各分子量酶解肽的抗肿瘤活性测定

木瓜蛋白酶酶解后的产物依次使用10,5，3 ku的超滤膜进行超滤,分别得到大于10,5～10，0～3 ku三个分子量范围的酶解物(由于酶解程度和样品的缘故,酶解物超滤后没有得到3～5 ku的组份),并迅速低温冷冻干燥。通过MTT法分析1 mg/mL的各分子量的水解产物对乳腺癌(MCF-7)和肝癌细胞(HepG-2)的抑制作用。

从图2和图3中可以看出木瓜蛋白酶不同分子量的酶解物对两种癌细胞均有显著的抑制作用,抑制率普遍在80%以上。其中,10 ku以上组份对HepG-2的抑制作用最强,抑制率高达96.35%,0～3 ku的多肽组分对MCF-7的抑制作用最强,抑制率高达90.6%。此外,相同浓度下同种组份对不同的癌细胞的抑制作用也不相同,如10 ku以上组分对MCF-7的抑制率是79.5%,明显低于其对HepG-2的抑制率96.35%,说明组分对癌细胞的增殖有一定的选择抑制作用。考虑到多肽的分子量范围和对两种癌细胞的抑制程度,选择0～3 ku的组份(设为组份P)进行下一步的分离纯化及抗肿瘤活性的检测。

图2　不同分子量酶解液对人乳腺癌细胞 (MCF-7)体外生长抑制作用Fig.2　Growth inhibition to MCF-7 in vitro of different hydrolyzates

图3　不同分子量酶解液对人肝癌细胞 (HepG-2)体外生长抑制作用Fig.3　Growth inhibition to HepG-2 in vitro of different hydrolyzates

2.3Sephadex G-15色谱柱层析及抗肿瘤活性的测定

由图4可以看出组份P分离纯化时,在280 nm检测波长下分离效果较好,故按280 nm检测结果收集分离产物为3部分,设为P1、P2和P3,将这三个组份冷冻干燥后,得到P1 20.6 mg,P2 12.8 mg和P3 6.7 mg,分别鉴定三个组份(500 μg/mL)对肿瘤细胞MCF-7和HepG-2以及人体正常肝细胞LO2的体外抑制作用,5-氟尿嘧啶为阳性对照,结果见图5。

表1　P2、P3和5-氟尿嘧啶(阳性对照)对两种癌细胞的抑制效果Table 1　In vitro anti-proliferation effects of P2,P3 and 5-Fluorouracil in two kinds of cell ±s,n=3)(%)

注:样品组的组间比较采用字母标示法,其中不同字母表示差异性显著(p<0.05),相同字母表示差异性不显著,具有统计学意义。

图4　木瓜蛋白酶酶解物0～3 ku超滤组分的洗脱曲线Fig.4　The elution curve of hydrolysates 0～3 ku of Papain

图5　木瓜蛋白酶酶解物不同组分对MCF-7、 HepG-2和LO2的体外生长抑制作用Fig.5　Growth inhibition to MCF-7,HepG-2 and LO2 in vitro of different Papain hydrolyzates

从图5中可以看出,P2对人乳腺癌(MCF-7)和人肝癌细胞(HepG-2)的抑制率较高,分别是83.63%和87.89%,P3对人肝癌细胞(HepG-2)的抑制作用较高,抑制率达79.12%,并且P2、P3对正常肝细胞LO2的抑制率分别是29.70%和16.77%,显著低于阳性对照的78.33%,说明P2、P3的安全性较好。将P2、P3和阳性对照5-氟尿嘧啶分别配成500、400、300、200、100、50 μg/mL,对两种细胞做浓度梯度实验(见表2～表4),求得各组的IC50值(见表5)。

从表2到5中可以看出P2组份对MCF-7和HepG-2均有较强的抑制作用,其抑制作用在50～500 μg/mL的梯度浓度内有一定剂量关系,即随样品浓度的增大,抑制作用增强,其相应的IC50值均显著低于阳性对照的IC50值,细胞毒性小,抗肿瘤活性显著。P3组份对HepG-2的IC50值是209.09 μg/mL,虽然其抗肿瘤活性低于阳性对照(IC50值122.72 μg/mL),但由图5可知,P3在500 μg/mL下对正常肝细胞LO2的抑制作用是16.77%,约是同浓度下P2细胞毒性的二分之一,显著低于阳性对照的78.33%,说明其安全性可靠,在50～500 μg/mL的梯度浓度内也呈剂量依赖关系,也可表现出一定的选择性抑制作用。

表2　各组份IC50值Table 2　The IC50 Value(μg/mL)of different components

2.4MALDI-TOF质谱数据的分析结果

根据2.3的实验结果,选择抗肿瘤活性较好的组份P2和P3进行一级质谱的鉴定。P2的一级质谱图如图6所示。P2中包含质荷比为957.478,1070.553,1092.538,1745.866和1846.855的五个信号响应值,其具体信息见表3。由表可知,在P2中主要含有5个多肽,其峰面积大小依次1092.538>1745.866>957.478>1846.855>1070.553。

图6　P2的一级质谱Fig.6　The MS data of P2

表3　5个多肽的质谱数据Table 3　The MS data of peptides from P2

表4　11个多肽的质谱数据Table 4　The MS data of peptides from P3

P3的一级质谱图如图7所示。在P3中主要含有11个多肽,其具体信息见表4。由表可知,P3中的成分较为复杂,其中质荷比为820.393、1046.555和1153.605的三个多肽的峰面积占总峰面积的百分比依次是20.58%、21.5%和12.28%,共占54.36%,其余多肽峰面积百分比较小,信号值较弱。

图7　P3的一级质谱Fig.7　The MS data of P3

3　结论

本研究以坛紫菜为原料,采用反复冻融和超声波破碎结合的方法提蛋白,使用木瓜蛋白酶进行酶解。酶解物超滤后共得到3个组份,结合癌细胞的体外抑制实验(MTT)对这3个组份进行筛选,筛选得到木瓜蛋白酶酶解物0～3 ku的组份(设为P)的抗肿瘤活性最优,当其浓度在1 mg/mL时,对MCF-7和HepG-2的抑制率分别是90.6%和90.05%。组份P经过葡聚糖凝胶柱Sephadex G-15分离纯化得到的组份P2,经MALDI-TOF-MS鉴定包含5个多肽,对MCF-7和HepG-2的IC50值分别是63.64 μg/mL和59.09 μg/mL,均低于阳性对照,抗肿瘤活性显著,组份P3,经MALDI-TOF-MS鉴定包含11个多肽,对HepG-2的IC50值是209.09 μg/mL,细胞毒性小,安全性高,对HepG-2有一定的选择性抑制作用。本研究对坛紫菜抗癌药物的开发提供了一定的理论基础,但是对多肽结构的鉴定和机理的研究还不够深入,有待于进一步分析,以充分开发其药用价值。

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Study on the anti-tumor activity of papain hydrolysis peptides derived fromPorphyrahaitanesis

BAI Lu,FAN Xiao-dan,ZHANG Xue-wu*

(College of Food Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Porphyrahaitanesisis an important economic algae with abundant nutrition.To explore the anti-tumor peptides fromPorphyrahaitanesis,the protein extracted with coalition of repeated freeing and melting and ultrasonic-extraction were hydrolyzed by papain.The obtained proteolytic peptides were separated and purified by ultrafiltration,Sephadex G-15 and MALDI-TOF-MS,the whole process was guided by MTT method.Results showed that the component P2 which contained 5 peptides purified from papain hydrolysates(called P,molecular weight 0～3 ku)had a strong anti-proliferation effect on both MCF-7 and HepG-2 cells,the IC50were 63.64 μg/mL and 59.09 μg/mL,respectively,both which were superior to the positive control 5-fluorouracil(IC50of MCF-7 and HepG-2 were 195.45 μg/mL and 122.72 μg/mL,respectively).While the component P3 which contained 11 peptides also had a certain selective anti-proliferation effect on HepG-2 cells with an IC50of 209.09 μg/mL.

Porphyrahaitanesis;enzymatic hydrolysis;peptide;anti-tumor;activity

2015-11-16

白露(1990-)，女，硕士，主要从事抗肿瘤功能食品的研究，E-mail:bailuhr1990@126.com。

张学武(1963-)，男，博士，教授，主要从事抗肿瘤功能食品的研究，E-mail:snow_dance@sina.com。

广东省省级科技计划项目(2014A020208017)；广东省海洋渔业科技推广专项科技攻关与研发项目(A201301B04)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)09-0352-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.061