LC-MS结合代谢组学技术鉴定真假白酒的研究

熊月丰,陈山乔,陶佳佳,肖新峰,倪　玲,包　斌,2,吴文惠

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海海洋大学海洋科学研究院,上海 201306;3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)



LC-MS结合代谢组学技术鉴定真假白酒的研究

熊月丰1,陈山乔1,陶佳佳1,肖新峰1,倪玲1,包斌1,2,吴文惠2,3，*

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海海洋大学海洋科学研究院,上海 201306;3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

本文研究了一种分析鉴定真假白酒的新方法。使用离心过滤方法处理某知名酒厂不同系列的白酒及其对应的假酒酒样,经LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)检测分析白酒酒样化合物信息,运用基于模式识别技术的代谢组学数据分析方法处理LC-MS数据集,对真假白酒数据进行降维处理。可以成功对真假白酒样品进行组学区分。LC-MS实验数据经一级聚类分析(Cluster Analysis)能辨别真假白酒样品,同时3类不同酒类品种之间形成吻合实际酒样信息的聚类信息。主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)法从同系列真酒的不同批次处于同一95%置信区域(Hotelling T2test)区分了真假白酒样品。PLS-DA分析(Partial Least Squares-Discriminate Analysis)法从特征性化合物MS信息显示真假白酒样品的差别,白酒真酒比白酒假酒处于更狭小的区域。结论显示LC-MS结合代谢组学技术是鉴定真假白酒的有效方法,该方法不但能区分真假白酒,还能反映不同系列真酒的相近程度及其特征性化合物信息。

真假白酒,LC-MS,聚类分析,PCA,PLS-DA

假酒为小作坊仿冒名酒而生产出的劣质产品。白酒掺假降低了产品品质,建立快捷可靠的掺假白酒区分方法具有非常重要的意义[1]。检测白酒品质的方法主要有傅里叶近红外光谱法、紫外可见吸收光谱法、核磁共振光谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法和电子鼻法等[2]。光谱法的仪器使用成本低,操作简单,但检测灵敏度有待提高。而电子鼻法能够满足现场检测的需要,但对模式识别的依赖性比较强,且缺乏准确性和定量检测的能力。色谱法为应用较为广泛的常规分析方法,选择性好,分离能力强,特别是LC-MS的分析方法,酒样预处理简单,能保持酒样的完整性,分析操作方便快捷,是优良的检测方法[2]。

基于LC-MS的代谢组学技术综合分析多种数据集的特征量或者目标物,是一种高判别能力,高稳健性的系统生物学方法,已经被广泛地应用于疾病诊断、疾病机理、毒理学、营养学、环境检测等领域[3]。代谢组学方法应用于食品的鉴别和质量控制的研究工作已有报道,因为代谢组学是基于全面分析食品成分组成的整体分析方法,在检测非特定目标物方面有其他检验方法所没有的优势[4]。Ogrinc等[5]利用同位素比质谱法(Isotope Ratio Mass Spectrometry,IRMS)对掺假的果汁、葡萄酒和橄榄油进行了分析研究,分析检测结果可以通过主成分分析法(Principle Component Analysis,PCA)或人工神经网络(Artificial Neural Networks,ANN)处理来区分正常产品和掺假产品。

目前,代谢组学技术方法在国外葡萄酒研究中有所应用[5],但是在国内的食品检测中应用较少,特别在白酒检测领域比较空白。现在,酒类分析使用较多的还是光谱分析和色谱分析等方法。例如,孙素琴等[6]利用了傅里叶变换红外光谱法区别鉴定了真假茅台酒样品,利用红外光谱宏观指纹性,建立白酒标准红外指纹图谱,达到了区分真假白酒的目的。万益群[7]等人将高效液相色谱法与化学计量学相结合,成功区分了江西地区的五类不同酒样。而范文来等[8]人将质谱与化学计量学结合进行了白酒产地鉴定,并建立了相关模型。

本文创新性的将LC-MS分析技术和代谢组学技术结合应用于白酒真假鉴定中。LC-MS方法样品无需冷冻干燥处理,预处理简单而迅速,可以更加充分的分析白酒酒体构成,获得尽可能多的化合物数据,这是其他研究所无法达到的。同时运用代谢组学技术,除了可以成功鉴别出真假白酒之外,还可以得到PLS-DA分析中的变量重要性(VIP)图,针对这些特征片段进行深入研究。相比现有的白酒检测方法,LC-MS结合代谢组学技术具有显著的优势。

为了研究分析鉴定真假白酒的新方法,本文对某知名酒厂白酒的不同系列酒样和假酒进行检测分析和多成分统计分析,显示LC-MS结合代谢组学技术是鉴定真假白酒的有效方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

由知名白酒品牌厂商提供的白酒样品:H系列酒样,Y系列酒样,S系列酒样,以及三个系列对应的假酒样品(假酒样品来源为厂商收缴所得的市场假冒商品),和该酒厂的基酒酒样。

液相色谱质谱联用系统美国Agilent公司:配有Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent 6538-UHD质谱,配有电喷雾离子源,飞行时间质量分析器,雾化器为氮气、工作站配有Agilent Mass Hunter数据处理软件;实验用水实验室自制超纯水,Millipore Simplicity超纯水系统上海彤迪科学仪器有限公司;用于高效液相色谱仪的甲酸、乙腈、氢氧化铵均为色谱纯德国CNW科技公司。

1.2实验方法

9个真酒和假酒的样品分别取5 mL,在3000×g、25 ℃条件离心10 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,处理好的样品用带盖玻璃离心管贮存于4 ℃冰箱备用。

样品检测的LC-MS条件列入表1。

表1　LC-MS实验参数表Table 1　LC-MS experimental parameters

1.3数据处理

LC-MS数据的归一化,特征识别使用基于R[9]的XCMS[10]软件包,模式识别方法HCA,PCA,PLSDA,使用MetaboAnalyst3.0[11]。其他统计分析由R软件[9]完成。

2　结果与讨论

2.1真酒和假酒的LC-MS分析

H系列酒样,Y系列酒样和S系列酒样经处理后,在优化设定LC-MS条件下得到样品总离子流图(图1)。

图1　白酒样品LC-MS总离子流图Fig.1　Total ion chromatogram of liquor samples under the condition of LC-MS

基于代谢组学技术,使用基于R的XCMS软件包对LC-MS数据进行了数据完整性检查和缺失值填充的数据预处理。

表2显示9个白酒样品从LC-MS得到的化合物信号峰在1851～2236之间,消除错误和极小峰,进行数据过滤,得到有效的1428个信号峰,暗示着真假白酒相关化合物约700个。

表2　基于LC-MS的白酒样品化合物相关信号峰Table 2　Compounds related signal peak of the liquor samples under the condition of LC-MS

另外,进行数据归一化处理(图2),归一化通过除以比例因子,将白酒样品化合物相关信号峰中所得离子浓度同时缩放,使得不同酒样的整体浓度水平恢复到相同的水平,以此放大被掩盖的信号峰。创新性的将LC-MS分析技术和代谢组学技术结合应用于白酒真假鉴定中。LC-MS可以更加充分的分析白酒酒体构成,获得尽可能多的化合物数据,样品无需冷冻干燥处理,白酒样品经过离心和微孔滤膜处理后能直接进行LC-MS分析,样品预处理简单而迅速。LC-MS检测分析白酒样品60 min,主要物质的保留时间是1～55 min,能分析约700种化合物,分析过程高效快捷。

图2　归一化数据处理的白酒样品化合物相关信号峰Fig.2　Normalized data processing of liquor samples compounds related signal peak

2.2白酒样品LC-MS相关化合物分层聚类分析

聚类分析是一种无监督的模式识别方法,对于样品的判别不进行预设的分组,对于测试数据的有效性验证,有价值信息的挖掘,预测模型的建立都是一种有力的统计学工具。涉及白酒的鉴定方面,所得到的分析图更是直接鲜明的得到真假白酒的区别[12]。

从图3中可以看到,第一级聚类就把真酒和假酒样品明显的区分开了,这印证了该方法具有直观的分辨效果。在假酒的三个样品中,把S系列酒样的假酒和Y系列酒样的假酒归为了一类,说明这两瓶假酒具有相似性。真酒酒样中同一系列的H1,H2和Y1,Y2各自被分为了同一类聚类,说明分层聚类分析的结果很好的把同一系列的不同批次的酒样归为一类,和实际的酒样信息吻合长方形区域右侧的数据值,为聚类分析所得白酒样品特征片段的质荷比/保留时间,其中颜色深代表该特征片段对应的化合物含量高,颜色浅代表其含量低。可以看到基酒样品分在真酒的类别当中,但是被单独归为一类,其化合物组成也较为特殊,是酒样品中比较独立的类别。

图3　白酒样品LC-MS相关化合物分层聚类 分析热投射图(HEAT-MAP)Fig.3　The hierarchical clustering analysis results of thermal projection diagram(HEAT-MAP)注:热图上端灰色长方形区域(HF,YF,SF)代表假酒, 黑色长方形区域(JICHU,S1,H1,H2,Y1,Y2)代表真酒。

2.3白酒样品LC-MS相关化合物主成分分析

PCA是一种基于最大统计学距离投影的降维方法,使用少量的综合变量(主成分)来取代原先的复杂多变量从而能在最大程度保留数据原有信息的情况下,降低数据复杂度,同时对数据进行可视化处理[13]。

从图4中可以看出,同一95%置信区域(Hotelling T2test)即浅色和深色椭圆区域,显示假酒样品和真酒样品得到了明显的区分,同时假酒里面S系列和Y系列的假酒较为相似,这和聚类分析的结果一致。而真假的三个系列中,H1、H2两瓶酒位置基本重叠,Y1、Y2位置也基本接近,可得该方法对同系列不同批次的酒样检测的稳健性,而S系列酒样,和Y系列酒样很接近,可推断它们的酒体结构上有一定的相似性。比较明显的是基酒,未被分类为假酒,离真酒样品集中区域也有一定距离,可推断基酒是酒厂酒样中比较特殊和独立的酒体系,这一信息也得到了酒厂的证实。结果分析可表明这种代谢组学技术可以很好地应用在白酒的真假酒区分和品质鉴定中。

图4　白酒样品LC-MS相关化合物主成分分析图Fig.4　Principal component analysis of liquor samples

2.4白酒样品LC-MS相关化合物偏最小二乘判别分析

为了进一步对特征化合物进行发现和筛选,引出一种有监督模式的识别方法,偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。和PCA相似,PLS-DA也是基于降维的多维向量分析方法,但是可以预设分类,其优势是可以尽量去除未控制变量对数据分析的影响,进一步挖掘数据中的信息,同时可以量化特征化合物造成组分差异的程度[14]。

图5　白酒样品LC-MS相关化合物PLS-DA图Fig.5　PLS-DA and chart

图6　去除基酒后的PLS-DA图Fig.6　PLS-DA after removal of base liquor and chart

考虑到基酒体系的独立性,所以在有监督模式下去除了基础酒,这样可以更突出真假白酒之间的物质区别。删除基酒后,真酒被分在了很集中的一个区域,更能凸显真酒的物质特征。同时在再一次验证了基础酒是较为独立和特殊的。该方法的运用不仅可以迅速建立真假鉴别模型,还可以给不同档次类型的酒样建立对应数据模型,更加丰富了白酒研究内容。

VIP(变量重要性得分值)越高的片段,越能表现真假白酒之间的区别[15],选取了前25个特征片段。黑色方块代表该碎片含量高,对应的灰色方块代表含量低。从图7中可得,344.3/1013片段,其VIP得分值在1.895,在假酒中含量很高,在真酒中含量较低。而另一个141.1/215片段该碎片在真酒中含量很高,在假酒中含量较低。对应的特征片段或特征化合物可作为识别真假白酒的特征物质。这类化合物的具体鉴定,需要在LC-MS实验过程中加入标准品确定。变量重要性(VIP)图,可以将真假白酒的特征化合物分析由图谱数据转换为相关的特征片段,这些特征片段不但能区分真假白酒也对白酒口感和风味研究具有重要意义。

图7　白酒样品化合物(片段)重要性(VIP)示意图Fig.7　Vriable importance(VIP)figure of liquor samples注：黑色代表含量高,灰色代表含量低。

3　结论

本文创新性的将LC-MS分析技术和代谢组学

技术结合应用于白酒真假鉴定中,样品无需冷冻干燥处理,LC-MS检测分析过程高效快捷。所得数据集经代谢组学技术降维处理,在聚类分析和主成分分析中,真酒和假酒清晰地分为两类,实验结果完全符合实际酒样信息。利用偏最小二乘判别分析迅速建立酒类相关模型,极大丰富该品牌白酒研究体系。得出变量重要性(VIP)图,将真假白酒的特征化合物分析由图谱数据转换为相关的特征片段,这些特征片段不但能区分真假白酒也对白酒口感和风味研究具有重要意义。

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Identification of true and fake Chinese liquors by LC-MS with metabolomics technology

XIONG Yue-feng1,CHEN Shan-qiao1,TAO Jia-jia1,XIAO Xin-feng1,NI Ling1,BAO Bin1,2,WU Wen-hui2,3,*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Institute of Marine Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Shanghai Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center,Shanghai 201306,China)

To design a new analysis method to identify true and fake Chinese liquors.Centrifugal filtering method was used to deal with some well-known Chinese different series of liquor and their corresponding wine liquor samples,by analyzing liquor compound information using a LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)and the true and fake Chinese liquors data dimension was a reduction processing through statistical analysis using metabolomics data analysis based on pattern recognition method.The impact of this new method was investigated in order to distinguish true and fake liquor samples group.In order to distinguish true and fake liquor samples,LC-MS experimental data by the level of clustering analysis(Cluster Analysis)were formed between the three kinds of different varieties of Chinese liquors by way of a real wine clustering information of sample information.PCA(Principle Component Analysis)method was also used to distinguish the true and fake of liquor samples from the same product of different by the 95% confident region revealed by Hoteling T2test.PLS-DA Analysis(Partial Least Squares-Discriminate Analysis)method from the characteristic of compound MS information display showed a narrow area for true wine liquor than fake liquor samples.In conclusion,LC-MS with metabolomics technology was an effective method for identification of true and fake Chinese liquors.This method not only can distinguish true and fake liquors,also can reflect the different series in the degree of similar compounds and its characteristic information of wine.

true and fake Chinese liquors;LC-MS;PCA;cluster analysis;PLS-DA

2015-10-14

熊月丰(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：食品分析检测，E-mail:yuefengeric@163.com。

吴文惠(1965-)，男，博士，教授，研究方向：海洋药物化学，E-mail:whwu@shou.edu.cn。

国家自然科学基金资助项目(81341082)；上海市科委工程中心建设(11DZ2280300)。

TS262.3

A

1002-0306(2016)09-0331-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.056