当归中关键气味活性化合物的鉴定及其在煎煮过程中变化规律研究

李泽仟,顾　欢,康　乐,张　亚,宋焕禄

(北京工商大学 分子感官科学实验室,北京 100048)



当归中关键气味活性化合物的鉴定及其在煎煮过程中变化规律研究

李泽仟,顾欢,康乐,张亚,宋焕禄*

(北京工商大学 分子感官科学实验室,北京 100048)

通过溶剂辅助风味蒸发制样(SAFE)和动态顶空制样(DHS)与气相色谱-嗅闻仪-质谱联机法(GC-O-MS)结合,对当归药材中的主要气味活性化合物进行分析,最终分别鉴定出43种和47种气味活性化合物。此外,采用香气提取物稀释分析(AEDA)和动态顶空稀释分析(DHDA)共同确定了贡献度较大的6种关键气味活性化合物:6-十一酮(泥土味、中药味)、藁本内酯(药草味)、丁烯基苯酞(药草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。最后,采用固相微萃取法(SPME)提取当归煎煮液的挥发性成分,并以内标法对关键气味活性化合物进行定量分析。结果表明:上述6种关键气味化合物在煎煮过程中含量发生改变,致使煎煮液清新香韵先增强后减弱,泥土香韵强度减弱,药草和咖喱香韵整体增强。

溶剂辅助风味蒸发制样,动态顶空制样,香气提取物稀释分析,动态顶空稀释分析,气相色谱-嗅闻仪-质谱

当归[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]是伞形科当归属的一种多年生草本植物。它是我国一味常用的中药材,始记于汉代《神农本草经》[1]。现代药理学研究表明,当归具有改善血液循环、抗炎和镇痛、清除自由基和抗脂质氧化、改善动脉硬化、补血、抗肿瘤和增强免疫功能等作用[2-3]。

目前针对当归挥发性成分的研究主要集中在全挥发油成分的分析上。近年来,一些新的提取技术已应用于样品制备中,如固相微萃取法(solid-phase micro-extraction,SPME)[4]、顶空无溶剂萃取法(headspace solvent free micro-extraction,HS-SFME)[5]和无溶剂固相注射法(solvent free solid injector,SFSI)[6]等。这些研究表明,当归全挥发油成分包含40～50种化合物。但在这些化合物中,并非所有分子都对当归的整体气味特征有贡献。所以,有必要采用分子感官科学的研究方法[7],并结合气相色谱-嗅闻-质谱仪(gas chromatography-olfactromrtry-mass spectrometry,GC-O-MS)确定当归药材中的关键气味活性化合物。

本实验首次将分子感官科学的研究方法应用于中药研究领域。采用溶剂辅助风味蒸发萃取法(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)和动态顶空制样法(dynamic headspace sampling,DHS)提取当归药材中的香气成分,然后分别以香气提取物稀释分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)和动态顶空稀释分析(dynamic headspace dilution analysis,DHDA)确定药材中关键气味化合物。最后,在100 ℃不同煎煮时间下,采用SPME提取煎煮液中的气味成分并以内标法对关键气味化合物定量,确定它们在煎煮过程中的变化规律。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

当归药材中国甘肃岷县;C7-C30正构烷烃和内标物2-甲基-3庚酮美国Sigma公司;二氯甲烷等其它试剂(分析纯)北京化学试剂公司。

气相色谱-质谱联用仪(7890A-7000B)美国安捷伦公司;Sniffer 9000嗅闻仪瑞士Brechbuhler公司;DB-Wax(30 m×0.32 mm×0.25 μm)和DB-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)型色谱柱美国J&W公司;溶剂辅助风味蒸发装置德国Glasbläserei Bahr公司;EXT75DX型复合涡轮分子真空泵和XDD1型机械泵英国Edwards公司;多功能全自动样品前处理平台MPS德国Gerstel公司;4848型高压反应釜美国Parr公司。

1.2当归药材的预处理及其煎煮液的制备

将当归研碎、过筛,选取过40目的粉末转移至50 mL离心管中并密封,然后放入温度为-20 ℃的冰箱内储藏备用。称取1.00 g上述当归粉末于高压反应釜内,加入30 mL蒸馏水,在温度100 ℃和不同时间(0～90 min)下煎煮。待煎煮完成后,将煎煮液转移至50 mL离心管内,并冷却至室温。然后,以转速5000 r/min离心10 min,过滤,滤液备用。

1.3气味物质前处理方法

1.3.1SAFE法处理药材样品及香气提取物稀释分析(AEDA)SAFE装置的安装和使用,按照Wolfgang Engel等[8]描述的方法操作。具体步骤如下:称取6.00 g当归粉末,加入100 mL二氯甲烷,在摇床中充分混合8 h。静置后,将混合体系进行过滤,所得萃取液在30 min内缓慢、均匀地滴入SAFE体系中的500 mL蒸馏瓶内,并将其置于50 ℃的恒温水浴中。另取250 mL圆底烧瓶作为接收瓶连接至SAFE体系上。为保证接收瓶处于低温环境,在瓶外装配保温套,并向保温套内持续灌入液氮。此外,在整个操作过程中使装置的冷阱中充满液氮。SAFE装置中的夹层循环水浴温度为50 ℃,分子涡轮泵使体系压力保持在10-4Pa。将接收瓶内提取液经无水硫酸钠干燥。然后,通过Vigreux柱浓缩至约2 mL,再采用氮气吹扫浓缩至0.5 mL。最终所得浓缩液供GC-O-MS分析使用。

香气提取物稀释分析(AEDA)采用SAFE提取液系列稀释(1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243),并将1 μL稀释样品注入GC-O-MS分析。每个稀释样品经3名有经验的评价员在仪器嗅闻口进行嗅闻评价。随着稀释倍数的增大,评价员不能再闻到某种香气化合物的气味为止,此时的稀释浓度比值为该化合物的FD因子(flavor dilution factor,FD)。一般来说,FD因子越高的化合物,对整体气味轮廓贡献越大。

1.3.2DHS法处理药材样品及动态顶空稀释分析(DHDA)称取1.00 g当归药粉,放于吹扫捕集玻璃容器中,并将体系密封。循环水浴温度为55 ℃平衡30 min。然后,将体系一端插入Tenax TA吸附管,另一端通入氮气。以氮气流速为100 mL/min吸附香气40、8、1.6和0.32 min,分别对应的FD因子为1、5、25和125。

1.3.3SPME法处理煎煮液样品当归粉末在不同条件煎煮后,采用SPME法对煎煮液的气味活性化合物进行分析。量取10 mL过滤后的煎煮液并置于40 mL萃取瓶内,加盖密封置于55 ℃水浴中,平衡时间为20 min,萃取针吸附时间为40 min。然后,插入气相色谱进样口解吸5 min。

1.4仪器条件

经GC分离后,分离馏分,分别进入质谱检测器和嗅闻检测器,实验人员在嗅闻口记录所闻到的香味特征和强度。馏分分离分别采用DB-Wax和DB-5毛细管柱。升温程序:初始温度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升温到200 ℃,保持0 min,再以10 ℃/min升温到250 ℃,保持5 min,共43 min。气相色谱使用的载气为氦气,流速为1.2 mL/min,分流比10∶1。质谱条件:电子轰击(Electron Impact,EI)离子源,电子能量70 eV,传输线温度280 ℃,离子源温度为230 ℃,四级杆温度为150 ℃,质量扫描范围55～500 m/z。

1.5香气化合物的鉴定与定量

化合物的鉴定主要采用NIST 2.0谱库、标准化合物保留指数(RI)和评价员嗅闻到的气味与标准化合物芳香特性相对比等方法。

化合物采用内标法定量,内标物在样品中的浓度为0.0816 μg/mL。每种化合物的浓度计算公式为:

ci=cis×Aj/Ais

式中:ci为化合物浓度;cis为内标浓度;Aj为化合物的色谱峰面积;Ais为内标物峰色谱面积。

2　结果与讨论

2.1当归中主要气味活性化合物的确定

表1和表2中鉴定的化合物主要包括萜烯类、醛类、酮类和芳香族化合物等,其中以萜烯类化合物为主。这与文献报道结果相同,如胡长鹰[9]对当归挥发油的不同提取方法进行探讨,并通过GC-MS分析得到β-罗勒烯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、藁本内酯和花侧柏烯等50种化合物;Hong-Sheng Tan等[6]采用SPME法对我国不同产地当归的挥发油成分进行分析,鉴定了51种挥发性成分。其中β-罗勒烯、α-蒎烯、3-甲基丁醛、庚烷和丁醛可作为潜在的指标化合物,用于评价道地和非道地的当归;卢森华等[10]研究了当归根、茎、叶不同部位的挥发油成分。然而,这些报道只针对当归的挥发油成分进行分析,既没有确定各种气味分子所体现的气味特征,也没有确定当归中的关键气味活性化合物。此外,本实验采用SAFE和DHS法提取挥发性成分,这对于感官嗅觉易辨别的低沸点组分有很好的提取效果[11]。

采用SAFE-GC-O-MS法提取、分离和鉴定出当归药材中43种主要气味活性化合物,见表1。当归药材的气味轮廓可描述为典型的药草香气、松木香、清新气味等,而鉴定的气味活性分子的气味特征很好地反映了这种气味轮廓。具有药草香气的化合物有丁烯基苯酞、藁本内酯、6-十一酮、β-甜没药烯、β-罗勒烯、桉油烯醇;呈松木香韵的化合物有月桂烯、桧烯、α-蒎烯、β-蒎烯、花侧柏烯;呈清香韵的化合物有己醛、辛醛、2-壬酮、壬醛和6-十一醇;此外,2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)和6-丁基-1,4-环庚二烯(甘草味)等具有其它气味特征的化合物也在这种方法下鉴定出来。通过AEDA确定了FD因子,FD因子越高对整体气味轮廓贡献越大。因此,表中6-十一酮、丁烯基苯酞和藁本内酯等8种Log3FD≥3的化合物是决定当归药材气味轮廓的关键气味活性化合物。

表1　AEDA法鉴定当归的主要气味活性化合物Table1　Predominant odorants in Radix Angelica sinensis identified by AEDA

注:a.评价员在嗅闻仪闻到的气味;b.保留指数RI=100N+100n(tR,a-tR,N)/(tR(N+n)-tR,N);N为标准烷烃的较低碳原子个数;n为标准烷烃之间相差的碳原子个数;tR,a,tR,N和tR(N+n)分别为未知化合物的保留时间,较低碳数的标准烷烃保留时间和较高碳数的标准烷烃保留时间;c.当样品浓缩液稀释至3、9、27、81、243和729倍时,对应的Log3FD分别为1,2,3,4,5和6,“-”表示没有闻到气味物质的特征气味;d.鉴定方法RI,O和MS分别表示采用保留指数、气味特征和质谱信息与标准化合物比对。

表2　DHDA法鉴定当归中的主要气味活性化合物Table 2　Predominant odorants in Radix Angelica sinensis identified by DHDA

注:a.评价员在嗅闻仪闻到的气味;b.保留指数RI=100N+100n(tR,a-tR,N)/(tR(N+n)-tR,N);N为标准烷烃的较低碳原子个数;n为标准烷烃之间相差的碳原子个数;tR,a, tR,N和 tR(N+n)分别为未知化合物的保留时间,较低碳数的标准烷烃保留时间和较高碳数的标准烷烃保留时间;c.当样品浓缩液稀释至0(不稀释)、5、25、125和725倍时,对应的FD因子分别为1、5、25、125和725,“-”表示没有闻到气味物质的特征气味;d.鉴定方法RI,O和MS分别表示采用保留指数、气味特征和质谱信息与标准化合物比对。

采用DHS-GC-O-MS对当归药材的气味活性化合物分析共鉴定出47种化合物,见表2。通过DHDA确定的关键气味活性化合物(FD≥5)有6-十一酮(泥土味、中药味)、α-蒎烯(松木味)、藁本内酯(药草味)、丁烯基苯酞(药草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)、β-蒎烯(松木味)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。比较AEDA和DHDA法发现,关键气味化合物略有不同,DHDA中体现松木气味的α-蒎烯和β-蒎烯更容易在顶空制样中嗅闻得到;AEDA中作为关键气味化合物的Alloaromadendrene并没有在DHDA中鉴定到。这种差别是由于不同的提取方法或不同吸附材料引起的。

综合溶剂萃取制样(SAFE)和动态顶空制样(DHS)两种方法,共同确定的关键气味活性化合物有6-十一酮(泥土味、中药味)、藁本内酯(药草味)、丁烯基苯酞(药草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。这些化合物主要贡献了当归药材的气味轮廓,它们可以作为煎煮过程变化规律的研究对象。

2.2关键气味化合物在煎煮过程中的变化规律

为了探索沸水煎煮过程中当归煎煮液气味活性化合物的变化规律,本实验采用SPME-GC-O-MS法对已确定的关键气味成分进行鉴定和定量,总离子流图见图1。图中有许多色谱峰,随之对应许多挥发性成分。然而,真正反映整体气味轮廓的关键气味成分只有少数几种。

当归煎煮过程中关键气味活性化合物随时间的变化趋势,如图2。在图2A中,呈现青草香气的己醛,其含量在煎煮时间为45 min时达到最大,随时间的延长,其含量逐渐降低;同样呈现清新气味的辛醛,其含量随煎煮时间的延长显著上升,并在75 min时达到最大值。在75～90 min,辛醛含量急剧下降;呈现泥土味的6-十一酮,随煎煮时间的延长,其含量逐渐降低。当煎煮时间大于45 min后,已很难检测到其含量;在图2B中,右侧附坐标轴标识的是呈现咖喱味的2-甲氧基-4乙烯基苯酚的含量。随着煎煮时间的延长,其含量显著上升;藁本内酯在60 min内含量略呈上升趋势,而继续煎煮含量会明显上升;对于丁烯基苯酞,随着煎煮时间的延长,其含量基本保持稳定。出现上述变化规律的原因主要是这些化合物从当归溶出到水中的速率和本身化学热稳定性决定的。

图1　当归煎煮液GC-O-MS总离子流图Fig.1　Total ion chromatogram of the Radix Angelica sinensis decoction by GC-O-MS

图2　当归煎煮过程中煎煮液关键气味化合物的变化趋势Fig.2　Variation trends of key odorants in the decoction by boiling process 注:图2b中2-甲氧基-4乙烯基苯酚的 含量由右侧坐标轴标识;丁烯基苯酞 和藁本内酯的含量由左侧坐标轴标识。

综上,随着沸水煎煮时间的延长,煎煮液气味特征变化如下:清新香韵先增强后显著减弱;泥土气味一直在减弱;刺鼻的咖喱气味一直在增强;整体中药味(或药草味)强度稳中增强。同时,这也与煎煮液的整体气味轮廓相符。

3　结论

通过采用SAFE和DHS两种风味提取技术,对当归药材中气味成分进行分析,分别鉴定出43种化合物和47种化合物。采用AEDA和DHDA并结合GC-O-MS共同确定6种关键气味,分别是6-十一酮(泥土味、中药味)、藁本内酯(药草味)、丁烯基苯酞(药草味)、己醛(青草味)、辛醛(清香)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(咖喱味)。采用SPME法提取当归煎煮液的挥发性成分,并以内标法对关键气味化合物进行定量分析。结果表明:这些化合物在煎煮过程中含量发生改变,致使煎煮液清新香韵先增强后减弱,泥土香韵强度整体减弱,药草和咖喱香韵整体增强。这在分子水平上解释了当归煎煮液在煎煮过程中宏观上的气味变化原因。

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Identification of key aroma-active compounds in RadixAngelicasinensisand study on its variation during boiling process

LI Ze-qian,GU Huan,KANG Le,ZHANG Ya,SONG Huan-lu*

(Laboratory of Molecular Sensory Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Predominant aroma-active compounds in RadixAngelicasinensiswere analysed by solvent-assisted flavor evaporation(SAFE)and dynamic headspace sampling(DHS),combined with gas chromatography-olfactromrtry-mass spectrometry(GC-O-MS).A total of 43 and 47 odorants were identified,respectively.In addition,aroma extract dilution analysis(AEDA)and dynamic headspace dilution analysis(DHDA)were carried out to screen the key aroma-active compounds in RadixAngelicasinensis.The result showed that 6 key odorants with stronger flavor properties in overall odor profile were identified:6-undecanone(earthy,herbal),ligustilide(herbal),butylidenephthalide(herbal),hexanal(cut-grass),octanal(green)and 2-methoxy-4-vinylphenol(curry-like).At last,the key aroma-active compounds identified above in RadixAngelicasinensisdecoction were extracted by solid-phase micro-extraction(SPME),quantified with internal standard method.The result showed that the contents of the 6 compounds varied during the boiling process so that the enhancement and reduction of green aroma,reduction of earthy aroma and enhancement of herbal and curry aroma were found in the decoction.

solvent-assisted flavor evaporation(SAFE);dynamic headspace sampling(DHS);aroma extract dilution analysis(AEDA);dynamic headspace dilution analysis(DHDA);GC-O-MS

2016-01-12

李泽仟(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品风味化学，E-mail:714512850@qq.com。

宋焕禄(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品风味化学, E-mail:songhl@th.btbu.edu.cn。

TS207.4

A

1002-0306(2016)09-0311-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.052