酵母代谢物对杂交鲟主要免疫指标及其抗病力影响的研究

文/王静波 潘勇 徐立蒲 王小亮 曹欢 王姝 张文

北京市鲟鱼、鲑鳟鱼创新团队专栏

酵母代谢物对杂交鲟主要免疫指标及其抗病力影响的研究

文/王静波 潘勇 徐立蒲 王小亮 曹欢 王姝 张文

夏季高温鲟鱼易发生细菌性疾病，研究发现高水温可使杂交鲟非特异性免疫降低，分析这个原因可能是导致其抗病力降低的主要原因。因此，2015年本团队研究了三种温度下投喂添加8‰酵母培代谢物的饲料对杂交鲟主要免疫指标及其抗病力影响的研究。测定了红细胞、白细胞数量、吞噬细胞免疫学指标的变化及血清中溶菌酶、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）的活性变化。结果显示：在三种水温条件下，各组红细胞和白细胞数量没有显著差别（P＞0.05），且各组红细胞数量均约为白细胞数量的100倍；各温度组中试验组（添加酵母组）血液中的白细胞吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）均显著高于对照组中的（P＜0.05），且各温度组试验组间无显著差异（P ＞0.05）；测定各温度组血清中酶活性变化显示：各温度组中试验组溶菌酶和SOD活性均显著高于对照组（P＜0.05），而各温度组中试验组T-AOC、ACP和AKP的活性与对照组无显著差异（P＞0.05）。经人工感染链球菌后，各温度组中试验组死亡率显著低于对照组（P＜0.05）。由以上研究结果可以看出，投喂添加酵母及其代谢产物的饲料可以提高养殖鲟鱼的抗病力。

一、材料和方法

1.试验鱼及饲养条件

杂交鲟（Acipenser baerii♂×Acipenser schrencki♀）（体长：17.5±2.0cm；体重：18.4±2.5g）购自北京怀柔某渔场。试验鱼暂养在0.5m3自动循环水养殖系统（溶解氧：6mg/L～8mg/L；pH：7.2～8.0），水温分别控制在（18±1）℃，（23±1）℃，（28±1）℃，期间每天投喂2次配合饲料，每天投喂相当于鱼体重1.5%的人工配合饲料。1周后开始试验。

2.供试菌株的培养

本研究中采用的链球菌（Streptococcus iniae）为本中心于2012年从鲟鱼体内分离到的链球菌（编号2012021）。将该链球菌从-80℃冰箱取出，室温溶解，取50μL加入BHI液体培养基，28℃培养18小时～24小时，再接种BHIA培养基，28℃培养18小时～24小时。用灭菌生理盐水调1.5×108cfu/mL。注射时再104倍稀释，即为104个/mL。每尾鱼注射0.15mL。

用于白细胞吞噬实验的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均购自中国微生物菌种保藏中心（北京）。将该菌在28℃恒温条件下，利用BHI培养基培养24小时。4000rpm离心20分钟收集菌体，以灭菌生理盐水清洗3次，加入终浓度为1%的甲醛溶液，继而在25℃条件下灭活24小时。然后4000rpm离心20分钟，重悬于灭菌生理盐水，重复二次，并将终浓度调至1×108cfu/mL，4℃保存备用。灭活的金黄色葡萄球菌简称F-S.a.。

3.酵母代谢物的投喂

本研究中所采用的酵母代谢物含有核苷、寡糖和有机酸等。将酵母代谢物按8‰的剂量添加在饵料中。试验鱼投喂添加酵母代谢物的颗粒饲料，对照组投喂未添加免疫增强剂的饲料。每天投喂相当于鱼体重1.5%的饲料，每天早、晚各一次，连续投喂21天。

4.采血

实验共设3个温度，分别设对照组和试验组（投喂酵母代谢物）。分别于投喂前和投喂结束每组取3尾鱼进行尾动脉取血，血样分为两份，一份加肝素，用于红细胞和白细胞计数；另一份按常规方法制备血清，存放于-80℃冰箱用于酶活性测定。

5.免疫指标检测

血细胞计数：红细胞和白细胞计数均用血球计数板计数，每个样品重复3次，结果以平均值计。

白细胞的吞噬：取各实验组鱼抗凝血分别经2000rpm离心10分钟后，吸取血浆与红细胞界面的白细胞层，用PBS（0.01M）重悬。取出200μL细胞悬液，加入40μL F-S.r。然后置于25℃恒温孵育，期间每10分钟摇匀一次。45分钟后2000rpm离心10分钟。弃上清，细胞用100μL PBS（0.01M）重悬。按常规方法涂三张载玻片，甲醇固定，Gimsa染色，油镜观察。

观察100个以上的白细胞，并计数其中吞噬了细菌的白细胞数，和被吞噬的细菌数。然后根据下面公式计算吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）：

吞噬百分比（PP）=（其中参与吞噬的白细胞数/计数的白细胞数）×100%

吞噬指数（PI）=（被吞噬的细菌数/100个白细胞）

血清中酶活性的测定：溶菌酶、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）均采用南京建成生物公司生产的相应试剂盒测定。

6.攻毒

免疫保护率（RPS）=［1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）］×100%

7.数据分析

所有实验数据均用平均值±标准差表示。利用SPSS 16.0软件对各组结果进行方差分析。

二、结果

1.血细胞数量变化

鲟鱼血细胞计数结果见表1。从表1可以看出，在三种水温条件下，各组红细胞和白细胞数量没有显著差别（P＞0.05），红白细胞之间的比例也基本保持不变，各组红细胞数量均约为白细胞数量的100倍；由此表明，温度和投喂免疫增强剂未对红白细胞数量产生影响。

表1　不同温度下各组杂鲟鱼血细胞数量

2.免疫增强剂对鲟鱼血清中酶活性的影响

（1）血清中溶菌酶活性的变化

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投喂添加酵母代谢物的饲料后，三种温度下对照和试验组鲟鱼血清中溶菌酶活性测定结果如图1所示。从图1可以看出，18℃和23℃对照组鲟鱼血清中的SOD活性显著高于28℃组（P＜0.05）。而三个温度下，投喂酵母代谢物的试验组鲟鱼血清中溶菌酶活性均显著高于对照组（P＜0.05）。

（2）血清中总抗氧化能力（T-AOC）

投喂添加酵母代谢物的饲料后，三个温度下对照和试验组鲟鱼血清中T-AOC活性测定结果如图2所示。从图2可以看出，三个温度下，投喂添加酵母代谢物的试验组鲟鱼血清中T-AOC活性均与对照组无显著差异（P＞0.05）；而三个温度组间鲟鱼血清中T-AOC活性均无显著性差异（P＞0.05）。

（3）超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化

投喂添加酵母代谢物的饲料后，三个温度下对照和试验组鲟鱼血清中SOD活性测定结果如图3所示。从图3可以看出，三个温度下，投喂添加酵母代谢物的试验组鲟鱼血清中SOD活性均显著高于对照组（P＜0.05）；从整体上看，18℃和23℃各组鲟鱼血清中的SOD活性显著高于28℃组（P＜0.05）。

（4）血清中酸性磷酸酶（ACP）活性的变化

投喂添加酵母代谢物的饲料后，三个温度下对照和试验组鲟鱼血清中ACP活性测定结果如图4所示。从图4可以看出，三个温度下，投喂添加酵母代谢物的试验组鲟鱼血清中ACP活性均略高于对照组，但是差异不显著（P＞0.05）；从整体上看，18℃和23℃各组鲟鱼血清中的ACP活性都略高于28℃组，但差异不显著（P＞0.05）。

（5）碱性磷酸酶（AKP）活性的变化

投喂添加酵母代谢物的饲料后，三个温度下对照和试验组鲟鱼血清中AKP活性测定结果如图5所示。从图5可以看出，三个温度下，投喂添加酵母代谢物的试验组鲟鱼血清中AKP活性均略高于对照组，但是差异不显著（P＞0.05）；从整体上看，18℃和23℃各组鲟鱼血清中的AKP活性都略高于28℃组，但差异不显著（P＞0.05）。

（6）酵母代谢物对鲟鱼外周血白细胞吞噬能力的影响

三种温度下对照组和试验组鲟鱼外周血白细胞的PP和PI变化如图3所示。结果表明，随着水温的升高，PP和PI整体上呈下降趋势；各温度组中试验组（添加酵母组）血液中的白细胞吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）均显著高于对照组中的（P＜0.05）（见图6和图7），且各温度组试验组间血液中的白细胞吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）无显著差异（P＞0.05）；而 18℃和23℃对照组的PP和PI均显著高于28℃组（P＜0.05），且18℃与23℃对照组间PP和PI差异不显著（P＞0.05）。同时，白细胞的吞噬实验结果发现，投喂酵母代谢物比未投喂免疫增强剂的鲟鱼外周血中白细胞具有更强的吞噬能力，每个白细胞能够吞噬更多F-s.a.（见图8）。从图8还可以看到，大量的F-s.a.已经被吞噬到细胞质中。

（7）攻毒后的存活率

三个温度组的对照及试验鱼经注射活链球菌攻毒后，均出现不同程度的死亡，从各组死亡鱼体内分离到的菌经鉴定均为链球菌。各组的死亡情况如表4所示。从表4可以看出，投喂酵母代谢物后的鲟鱼均获得了一定的免疫保护率，而在饲料中添加酵母代谢物的试验组鱼体死亡率明显的低于未添加酵母代谢物的对照组，23℃试验组获得免疫保护率最高，18℃试验组次之，28℃试验组最低。

表2　活菌攻毒后鲟鱼的死亡率和免疫保护率

图8　外周血吞噬细胞吞噬F-S.r （A）对照组 （B）免疫组

从以上结果可以看出，在杂交鲟正常生存水温和高水温下，投喂酵母代谢物可以提高鲟鱼非特异性免疫指标，同时，投喂酵母代谢物后的杂鲟均获得了一定的免疫保护率，添加酵母代谢物的试验组鱼体死亡率明显的低于未添加酵母代谢物的对照组进而提高鲟鱼抗病力。

三、讨论和结论

Engstad和Jorgensen等人的研究表明酵母葡聚糖能够增强虹鳟、大西洋鲑和大菱鲆体内溶菌酶活性。本研究的结果也表明，在饲料中添加酵母代谢产物可以增强杂交鲟鱼溶菌酶活性，并且在高水温条件下试验鱼的血清中溶菌酶活性也随之增强。国外一些学者的研究表明，酵母葡聚糖能够增强水产动物的巨噬细胞的杀菌活性，并能提高巨噬细胞中超氧化物的产量，本研究中对试验鱼的白细胞吞噬活性的测定结果也表明，投喂添加酵母代谢物的鲟鱼的白细胞吞噬活性显著高于对照组（P＜0.05）。

Raa等人（1992）也曾报道口服酵母葡聚糖能增强大西洋鲑对螨弧菌（Vibio anguillarum）和杀鲑弧菌（Vibrio salmonicida）的抵抗力。Baulny 等人发现对浸泡接种了V.anguillarum的大菱鲆投喂酵母葡聚糖可使其获得比单独接种疫苗的鱼更强的保护力，同时，他们发现，单独投喂酵母葡聚糖并不能增强大菱鲆对V.anguillarum的抵抗力。本研究结果也表明在常温和高水温条件下，对注射接种了链球菌的杂交鲟投喂酵母代谢物可以增强试验鱼对链球菌的抵抗力，降低活菌攻毒后的死亡率。因此，在高水温和鲟鱼病害高发季节时，可以通过投喂添加酵母代谢产物提高鲟鱼抗病力。

作者单位：北京市水产技术推广站