新疆驴盲肠细菌多样性分析

赵金香，张瑞十，赵义龙2，杜国丰，马志研，矫继峰*（.营口理工学院，辽宁　营口　504；2.新疆农业职业技术学院动物科技学院，新疆　昌吉　8300）

新疆驴盲肠细菌多样性分析

赵金香1，张瑞十1，赵义龙2，杜国丰1，马志研1，矫继峰1*
（1.营口理工学院，辽宁营口115014；2.新疆农业职业技术学院动物科技学院，新疆昌吉831100）

为探索新疆驴耐粗饲的根本原因，本试验选取新疆驴6头，以16s rRNA文库法，对新疆驴盲肠细菌进行了系统的分类和鉴定。研究结果表明，新疆驴盲肠细菌资源丰富，共获得Verrucomicrobiae，Spirochaetales，Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria，Bacteroidetes，Bacilli，Negativicutes，Erysipelotrichia以及Clostridia共9个纲的细菌。其中厚壁菌门的Clostridia为新疆驴盲肠优势细菌（约占盲肠细菌总量的83%）。对梭状芽胞杆菌纲进一步分类发现，其所有克隆全部归属于梭菌目 （Clostridiales），其中，Ruminococcaceae与Lachnospiraceae分别为梭菌目的两大优势菌科。上述结果说明，厚壁菌门的Ruminococcaceae与Lachnospiraceae的细菌是新疆驴盲肠内的优势菌群，在新疆驴耐粗饲方面可能起重要作用。

新疆驴；盲肠；细菌；多样性

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.04.004

新疆驴是新疆原始的小型地方优良驴品种之一，2008年被列为国家级畜禽遗传资源保护品种，在我国家畜品种遗传资源中占有重要的地位[1]。其耐粗饲，适应干旱能力强。尽管新疆驴可役用于交通及生产，而且还可用于经济用途，如肉、乳、药等，但目前新疆驴的养殖规模却逐渐缩小[2]。

动物及人类的肠道微生物不仅受遗传因素影响，而且还是一个非常复杂的多种微生物共存的环境。越来越多的研究表明，肠道微生物与动物及人类的健康密切相关[3-9]。据报道，新疆驴对秸秆饲料的干物质采食量显著高于青贮饲料[10]。因此，新疆驴肠道微生物种类及组成与其耐粗饲的特性一定存在着必然的联系。

为探索新疆驴耐粗饲的根本原因，本研究采用免培养法对肠道细菌进行全面系统的鉴定，以期找到细菌与其耐粗饲之间的相关关系，为新疆驴综合生产性能的开发打下基础。

1　材料与方法

1.1试验动物的选择及样品采集

选择3～4岁、体重（130±15）kg的6头（雌雄各半）健康新疆驴为试验对象。以麦秸、玉米秸秆、稻草等量混合作为粗料，并辅以一定量的精料，饲养60 d后，以体外腹腔穿刺法收集盲肠液于-20℃保存备用。

1.2肠道微生物基因组提取

采用粪便基因组提取试剂盒（购自Omega公司）对肠道微生物基因组DNA进行提取，严格按照试剂盒的说明书进行操作。并应用Nanodrop1000核酸定量仪（购自Thermo公司）进行总DNA浓度测定，-20℃保存备用。

1.3细菌16S rDNA特异性片段扩增

PCR反应在PCR扩增仪（购自杭州博日科技）中进行。反应引物序列为8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs，美国），反应设置为35个循环。首先98℃预变性1 min，然后98℃10 s，56℃30 s，和72℃60 s，72℃8min。

PCR结束后对其产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，然后应用胶回收试剂盒（购自Axygen）对胶进行回收，以及进行DNA链3'端腺嘌呤A的连接反应，连接酶是TaqDNA Polymerase（购自天跟生化科技），反应条件为72℃30 min。反应结束后继续采用1%琼脂糖凝胶与胶回收实验纯化得到3'端具有polyA结构的细菌16S rDNA。

1.4克隆文库的构建及检测

将上述纯化后的PCR产物通过T4DNA连接酶与pMD18-T vector连接后，转化至E.coli DH5α感受态细胞中。通过蓝白斑筛选，将白色克隆菌斑接种于96孔细胞培养平板中于-70℃保存备用。

文库的克隆，以M13-F:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，M13-R:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'为引物，通过菌体PCR鉴定插入子的正确性。插入正确的菌体，其PCR产物进行限制性片段长度多态性（RLFP）分析。分析图谱中差异条带于华大基因进行测序。

测序所得序列通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)与GenBank数据库中已知序列进行比对分析。应用MEGA软件对细菌序列进行多重序列比对；应用mothur软件以97.0%相似性为标准划分不同的操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）[11]；应用AnalyticRarefaction软件绘制克隆文库的稀释曲线(Rarefactioncurve)，以检验文库的代表性；应用软件SPADE(Species Prediction And Diversity Estimation)进行细菌多样性指数分析；应用Classifier软件进行分类分析。

2　结果与分析

2.1新疆驴肠道基因组DNA的提取及16SrDNA的扩增

为了能够高效提取新疆驴肠道中的微生物基因组，由于肠道内容物与粪便结构相似，我们选择了粪便基因组提取试剂盒。提取的基因组DNA电泳条带清晰。以此DNA为模板，经细菌16S rDNA特异性引物扩增后，在1 500 bp处出现特异性条带，与实验预期结果一致，表明成功扩增并得到了肠道中细菌特异性片段。

2.2克隆文库的构建及检测

将所得细菌16S rDNA特异性片段与T载体连接后，转化至感受态细胞DH5α中，随着细胞的繁殖而迅速扩增。通过蓝白斑筛选共得到219个阳性克隆的菌株。这些阳性克隆通过HaeIII进行酶切RLFP分析后，排除重复酶切图谱，将197个阳性克隆菌进行测序。测序结果经比对分析，得到145个细菌克隆，分属23个OTU（可操作单元）。

为了评估文库构建的可行性，我们评估了文库的覆盖率C（Estimated sample coverage）以及文库的稀有度（图1）。由于C值为0.915，表明本次样本覆盖了新疆驴盲肠全部细菌的91.5%；而且稀有度曲线随着克隆数的增加具有趋向平缓的趋势，表明本次所取样品中，所得的细菌数量基本能够代表驴肠道中细的真实情况。

图1　新疆驴盲肠细菌稀有度曲线Figure 1 Rarefaction curve for Xinjiang donkey cecum bacteria OTUs of 16S rDNA gene clones

2.3细菌多样性分析

为了探索新疆驴盲肠内细菌的复杂程度，根据所获得的细菌样品，进行了细菌多样性指数分析（表1）。根据ACE（Abundance-based Coverage Estimator）模型预测，在95%置信区间（28.0,82.1）内，本研究的物种丰度为40.2±12，实际研究中检测到了24个OTUs，比预测结果偏低。根据Chao&Shen模型与MLE （maximum likelihood estimator），在95%置信区间 （1.979,2.702）(0.08633,0.29514)内，香农指数（Shanno Index）与辛普森指数（Simpson Index）分别为2.340±0.184与0.19074±0.05327。通常，物种多样性越丰富，这两个指数越大；标准误越小，表明所得细菌样本越能代表驴盲肠细菌总体。本研究表明，通过盲肠取样检测所得新疆驴盲肠细菌多样性，基本能够代表其盲肠总体细菌多样性。

表1　新疆驴盲肠细菌多样性指数分析

2.3细菌分类分析

为了探索新疆驴盲肠细菌的特性，我们对所得细菌进行了分类分析。本研究共得到145个细菌克隆，分别分属于疣微菌门、螺旋体门、变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门以及未界定的细菌门（表2）。其中，（图2）厚壁菌门（Firmicutes）梭状芽胞杆菌纲（Clostridia，82.76%）是新疆驴盲肠细菌的优势细菌，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）拟杆菌纲（Bacteroidetes，5.52%）与变形菌门（Proteobacteria）δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria，4.14%）。本研究表明新疆驴盲肠细菌主要为厚壁菌门梭状芽胞杆菌纲。

为了进一步探索新疆驴盲肠中细菌的功能，我们对梭状芽胞杆菌纲作了进一步的分类（表3）。其所有克隆全部归属于梭菌目 （Clostridiales）。他们分别是梭菌目的真杆菌科 （Eubacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）以及21个未定科的克隆。其中，瘤胃球菌科与毛螺菌科为两个优势菌科（图2）。

表2　　新疆驴盲肠细菌分类及统计结果

表3　　新疆驴盲肠梭状芽胞杆菌纲梭菌目的分类及统计结果

图2　　新疆驴盲肠细菌结构组成Figure2 Community structure of the cecum bacteria in Xinjiang donkey

3讨论

新疆驴是一个耐粗饲的地方优良品种，主要分布在喀什、和田、克孜勒苏柯尔克孜自治州、巴音郭愣蒙古自治州、吐鲁番、哈密等地[12]。新疆属大陆性气候，受高山和沙漠的影响，气候温暖而干旱，风沙多，降水量少。由于生存环境恶劣，新疆驴形成了独特的特性以适应干旱的环境，如体格矮小、体质结实，具有发达的盲肠，肠道内部含有大量的微生物，是其对粗饲料进行消化分解的主要场所[13]，类似于反刍动物的瘤胃。动物对粗饲料消化的研究，大量的报道集中于反刍动物的瘤胃，而驴盲肠的研究报道很少。本研究通过对新疆驴盲肠微生物组成及分类的研究表明，厚壁菌门（Firmicutes）是新疆驴盲肠主要的优势细菌，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）与变形菌门（Proteobacteria）。

厚壁菌门是一大类细菌，多数为革兰氏阳性，很多厚壁菌可以产生芽孢，用以抵抗脱水和极端环境。动物肠道中的厚壁菌属于化能营养型细菌，能帮助动物从食物中获取更多的能量[14]。基于这一现实，新疆驴盲肠中之所以以厚壁菌门为主要优势菌，可能与其能够从粗饲料（如秸秆饲料）中获取更多的营养物质相关。新疆气候炎热、干燥，新疆驴在长期自然选择过程中逐渐形成了以厚壁菌门为主的肠道优势菌群，以至于其充分利用这类能够抵抗极端环境的细菌帮助消化粗纤维含量丰富的秸秆饲料，获取更多的营养物质。本研究中，厚壁菌门约占盲肠细菌总量的83%。这一结果表明，以纤维素为主要食物的新疆驴肠道中饲料提供的营养在转变为动物可吸收营养的过程中，厚壁菌门细菌起着至关重要的作用。

为了进一步确定厚壁菌门细菌在新疆驴消化粗纤维类饲料过程中的作用，本研究对该门细菌作了进一步的分类和鉴定。经鉴定，新疆驴盲肠中厚壁菌门细菌主要归属于梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）梭菌目（Clostridiales）瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）。尽管如此，在瘤胃球菌科中，接近80%的盲肠细菌均为未定属。另外，在毛螺菌科（Lachnospiraceae）中，也有超过90%的细菌未定属；在梭菌目中有18%的细菌未定科。这些研究结果表明，新疆驴盲肠具有非常复杂的微生物组成，而且还有大量的细菌需要作进一步探索和研究。这些未知功能的细菌在新疆驴对粗纤维饲料消化及吸收过程中所起的作用，尚需要进一步的研究。

综上所述，本研究通过16S rDNA文库法，对新疆驴盲肠细菌进行了分类及鉴定。研究结果表明，厚壁菌门为新疆驴盲肠细菌的主要优势菌群。另外，本试验所采用的16S rDNA免培养法有助于对动物肠道新细菌的发现。

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Analysis on Cecum Bacteria Diversity in Xinjaing Donkey

ZHAO Jin-xiang1，ZHANG Rui-shi1，ZHAO Yi-long2，DU Guo-feng1，MA Zhi-yan1，JIAO Ji-feng1*
（1.Yingkou Polytechnic Institute,Yingkou Liaoning 115014，China；2.Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science of Technology,Aler XinJiang 831100，China）

To explore the causes of resisting roughage feed in Xinjiang donkey,six Xinjiang donkeys are selected,and their cecum bacteria aresystematically classifies and identifies by 16s rRNA gene library.It is found that thebacteria in Xinjiang donkey is much rich and the retrieved clones belong to 9 classes in 5 phylum,namelyVerrucomicrobiae，Spirochaetales，Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria，Bacteroidetes，Bacilli，Negativicutes，Erysipelotrichia and Clostridia.And Clostridia(accounts for 83%in total cecum bacteria amount)is predominant bacteria in cecum of donkeys.Further study shows that the Clostridia bacteria belonged to Clostridiales,Ruminococcaceae and Lachnospiraceae are two dominant bacterias in Clostridiales. The said results indicates that Ruminococcaceae and Lachnospiraceae aree the two big dominant bacterias in the cecum and could play a key role in resisting roughage feed in Xinjiang donkey.

Xinjiang donkey;cecum;bacteria;diversity

S822

A

1003-6377（2016）04-0020-06

赵金香(1979-)，女，硕士，副教授。主要研究方向：动物营养与生物化学。E-mail：zjxdky@126.com

矫继峰(1977-)，男，博士，副教授。主要研究方向：生物化学与分子生物学。E-mail：jiaojf08@sohu.com

2016-05-15

2016-05-24