低氧对人牙周膜干细胞骨向分化的影响

刘衍钊，孙世林，顾 旷，刘 雨，邹多宏，王元银



低氧对人牙周膜干细胞骨向分化的影响

刘衍钊，孙世林，顾 旷，刘 雨，邹多宏，王元银

目的 探讨低氧对人牙周膜干细胞（PDLSCs）骨向分化的影响。方法 采用组织块法体外分离培养PDLSCs，分别在常氧和低氧条件下培养PDLSCs，低氧组在2%O2浓度下培养6、12、24、48 h后检测其碱性磷酸酶（ALP）活性，并通过荧光定量PCR检测低氧培养的PDLSCs中骨钙素（OCN）、低氧诱导因子1α（Hif-1α）、碱性磷酸酶（ALP）以及成骨相关基因核心结合因子（Runx-2）等基因的表达变化；通过Western blot法检测低氧培养的PDLSCs中Runx-2、Hif-1α等蛋白的表达变化。结果 低氧组的PDLSCs的ALP水平高于常氧组，但低氧48 h开始抑制ALP水平，荧光定量PCR和Western blot结果显示低氧培养48 h内的PDLSCs的成骨能力高于常氧组，但低氧培养48 h则抑制其成骨能力。结论 48 h内低氧可显著增强PDLSCs骨向分化作用，48 h则开始抑制其成骨能力。

牙周膜干细胞；低氧；骨向分化

网络出版时间：2016-6-6 13：52：32 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.020.html

牙周膜是一种有高度韧性的结缔组织，有丰富的血管网，为周围的细胞提供了丰富的氧气［1］。对于牙周病患者，由于慢性炎症其牙周的血管受损，使得牙周细胞处于低氧状态［2］。在进行牙齿正畸牵引时，作用于牙齿的机械应力会通过牙周膜传递到牙槽骨上，机械应力会引起牙周膜压力区循环障碍和低氧，导致牙周膜细胞处于低氧环境中［3］。低氧是肿瘤微环境、缺血性疾病、以及组织损伤的一个重要组成部分［4-6］。当机体处于贫血、外伤、组织坏死等情况下，组织或细胞通常会处于低氧状态。低氧导致一系列转录诱导因子的表达，其中，低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor，Hif-1α）对血管的形成及细胞的生长起决定性作用［7］。近年来研究［8］显示，Hif-1α除了可以诱导血管生成外，对骨形成也有一定的作用。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周组织中的成体干细胞，有高度增殖、自我更新能力和多分化潜能，在一定的条件下可以诱导其骨向及血管向的分化［9］。PDLSCs的生理病理活动是在低氧状态下进行的，牙周膜是位于牙槽骨和牙骨质之间高度血管化的组织，长期处于咬合及咀嚼作用导致的机械负荷下；患有牙周炎以及进行正畸的患者，由于炎症以及过度的机械力使得牙周组织严重受损，这都导致了PDLSCs处于一种低氧的微环境中［10］。该研究通过探讨低氧对于PDLSCs的成骨能力的影响，以期对于牙周炎患者牙周组织进行有效的修复。

1　材料与方法

1.1材料 DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国HyClone公司）；青霉素100 U/ml、链霉素100 mg/L、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；低氧培养箱（德国MEMMERT公司）；高速冷冻离心机（美国Centrifuge公司）；超微量分光光度计（美国NanoDrop公司）；超净工作台（中国苏州净化公司）。

1.2PDLSCs的分离和培养 选择11～18岁因正畸需要减数拔除的前磨牙，收集前获得患者及其监护人的知情同意。取材后，在超净工作台内，将牙齿牙冠向下用PBS冲洗牙齿30 s，然后将牙冠部分浸入75%酒精内消毒约2 min，再用 PBS冲洗30 s，无菌条件下用锐利手术刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜组织；在DMEM培养液浸润下，剪成1 mm×1 mm ×1 mm的碎块，均匀铺于6孔板底部，用盖玻片压紧，加入2 ml含20%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L的链霉素的DMEM培养液。置于37℃、饱和湿度条件下培养，每3 d换液，约7～15 d当细胞从组织块周围游出并达70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化传代，首次传代比例为1∶1。

1.3低氧培养PDLSCs 将状态良好的P2～P3代PDLSCs以5×104个/ml的密度接种于6孔板中，在常氧培养箱（含20%O2、5%CO2和75%N2）中培养3 d，然后将细胞分为两组，低氧组（2%）和常氧组（20%），低氧组和常氧组分别设置6、12、24、48 h 4个时间点，低氧组的细胞置于含2%O2、5%CO2和93%N2的低氧培养箱中培养。

1.4碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性将PDLSCs以5×104个/ml的密度接种于含20% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L的链霉素的DMEM培养基的6孔板中，培养6、12、24、48 h收集细胞通过ALP检测试剂盒检测细胞的ALP活性。实验重复3次。

1.5RNA提取及荧光定量PCR 使用TRIzol Reagent提取不同时间点细胞的总RNA，通过Prime-ScriptTMRT试剂盒进行逆转录。使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司）进行 PCR的扩增，总反应体系20 μl。所涉及的引物序列见表1。

表1　荧光定量　PCR引物序列

1.6总蛋白提取及Western blot法检测 在不同的时间点用RAPA蛋白裂解液裂解细胞，冰上放置30 min，4℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液。使用BCA蛋白试剂盒（中国碧云天公司）检测蛋白浓度。按4∶1的比例向样本中加入蛋白上样缓冲液，100℃煮10 min。SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将蛋白质电转至PVDF膜上，0.5 g/L脱脂牛奶（中国光明公司）封闭膜上的非特异性位点。孵育一抗，二抗，用化学发光法ECL Western blot试剂盒（英国Amersham Biosciences公司）检测抗原抗体复合物。GAPDH作为内参对照。

1.7统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行分析，两组数据间的比较采用t检验。

2　结果

2.1原代PDLSCs 培养7～15 d时镜下可见从组织块周围爬出的长梭形PDLSCs（图1）。待原代细胞融合至孔底的80%时，按1∶1传代。

图1　原代PDLSCs ×40

2.2低氧对于PDLSCs ALP活性的影响 与常氧组比较，低氧组 PDLSCs的ALP活性逐渐增加，但低氧培养48 h的PDLSCs的ALP活性则显著下降，与常氧组差异无统计学意义。其中低氧12 h（t= 4.79，P＜0.05）、24 h（t=4.70，P＜0.05）差异有统计学意义，6、48 h差异无统计学意义（图2）。

图2　低氧对于PDLSCs ALP活性的影响

2.3低氧对于PDLSCs成骨基因表达的影响 与常氧组比较，低氧组PDLSCs的成骨相关基因核心结合因子（runt-related transcription factor 2，Runx-2）均高表达，其中低氧12、24、48 h差异有统计学意义（t=5.738 85、14.008 61、4.982 24，P＜0.05），6 h差异无统计学意义。骨钙素（osteocalcin，OCN）和ALP表达24 h差异有统计学意义（t=4.071 25、8.414 82，P＜0.05），6、12、48 h差异无统计学意义。低氧组Hif-1α表达高于常氧组，但48 h低氧组Hif-1α则无表达，其中低氧12 h差异有统计学意义（t= 6.220 65，P＜0.05），低氧6、24 h差异无统计学意义（图3）。

2.4低氧对于PDLSCs成骨蛋白表达的影响 与常氧组比较，低氧组6、12、24、48 h Runx-2和Hif-1α的表达均明显高于常氧组（图4）。

图3　低氧对于PDLSCs骨向基因　Runx-2、OCN、Hif-1α、ALP表达的影响

图4　低氧对于　PDLSCs成骨蛋白表达的影响

3　讨论

氧气对于几乎所有的生命都是不可缺少的，其能维持细胞的代谢和功能，当机体生命活动所需的氧不能得到充足的供给时，组织细胞就会处于一种乏氧代谢的过程中。由于向组织中供应的氧气不足，会引起一些生理及病理性的变化，并且还会导致胚胎和成体干细胞的生理特性的改变。在牙周组织中，低氧是引起牙周炎的重要因素之一。正常牙周组织中的氧含量为2.9%～5.7%，但当牙周组织发生病变时，牙周组织的血流量减少，造成供氧不足，引起牙周组织炎症，从而导致牙周细胞处于局部性的 低氧环境中［11-13］。

PDLSCs作为牙周来源的间充质干细胞，有高度增殖、自我更新、多向分化的潜能，并且能够形成牙骨质及牙周组织，可作为牙周组织再生的重要种子细胞。Runx-2作为成骨细胞的特异性转录因子，调控并诱导成骨细胞分化和骨的形成。OCN由成骨细胞合成和分泌，由于OCN主要在矿化形成期出现，所以还被认为是成骨细胞向矿化期分化的标记之一。本实验利用荧光定量PCR技术与Western blot检测Runx-2、OCN、Hif-1α、ALP 4种成骨指标，结果显示，无论从基因水平还是蛋白水平，48 h内低氧促进PDLSCs的骨向分化能力。通过在低氧环境下诱导干细胞的成骨分化，对牙周组织及骨组织的缺失来进行有效的修复。

到目前为止，低氧对于PDLSCs骨向分化影响的机制没有被完全明确，以往骨髓间充质干细胞由于其易于取得并且有良好的成骨能力受到广泛关注［14］。一些生理微环境，例如机械应力、低氧等在骨再生中发挥着重要作用，尤其是低氧被认为是调控成骨分化的关键。PDLSCs作为牙周组织来源的间充质干细胞，其STRO-1/CD146的表达和骨髓间充质干细胞类似，在体内可以形成牙骨质及牙周膜，使得PDLSCs成为一种独特的干细胞［15］。最近的研究［16］表明，低氧环境可以上调转录因子Runx-2的表达，激活多种细胞外信号通路，如MEK/ERK和p38 MAPK通路，继而启动成骨相关特异性基因的转录及上调其表达促进矿化结节的形成以及ALP活性的升高，诱导其骨向分化。MAPK信号通路被认为是骨向分化以及成骨相关基因表达的关键，MAPK信号通路能够磷酸化Runx-2，继而启动成骨特异基因的转录。ERK在细胞外基质诱导成骨中也发挥着重要作用。目前对于低氧的研究越来越多，但由于试验中对于氧气浓度的选择，干细胞来源以及种类的不同，使得研究结果并不一致，对于低氧的研究仍然具有争议，因此需要进一步的研究。

［1］Wu Y，Yang Y，Yang P，et al.The osteogenic differentiation of PDLSCs is mediated through MEK/ERK and p38 MAPK signalling under hypoxia［J］.Arch Oral Biol，2013，58（10）：1357-68.

［2］Pradeep A R，Prapulla D V，Sharma A，et al.Gingival crevicular fluid andserum vascular endothelial growth factor：their relationship in periodontal health，disease and after treatment［J］.Cytokine，2011，54（2）：200-4.

［3］Ku S J，Chang Y I，Chae C H，et al.Static tensional forces increase osteogenic gene expression in three-dimensional periodontal ligament cell culture［J］.BMB Rep，2009，42（7）：427-32.

［4］Paris S，Denis H，Delaive E，et al.Up-regulation of 94-kDa glucose-regulated protein by hypoxia-inducible factor-1 in human endothelial cells in response to hypoxia［J］.FEBS Lett，2005，579 （1）：105-14.

［5］Sluimer J C，Gasc J M，van Wanroij J L，et al.Hypoxia，hypoxiainducible transcription factor，and macrophages in human atherosclerotic plaques are correlated with intraplaque angiogenesis［J］. J Am Coll Cardiol，2008，51（13）：1258-65.

［6］Salim A，Nacamuli R P，Morgan E F，et al.Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx-2 expression in osteoblasts［J］.J Biol Chem，2004，279（38）：40007 -16.

［7］Patella F，Rainaldi G.MicroRNAs mediate metabolic stresses and angiogenesis［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（7）：1049-65.

［8］Li L，Han M X，Li S，et al.Hypoxia regulates the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells under cyclic tensile stress via mitogen-activated protein kinase pathways［J］.J Periodontol，2014，85（3）：498-508.

［9］Seo B M，Miura M，Grenthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364（9429）：149-55.

［10］Wu Y，Cao H，Yang Y，et al.Effects of vascular endothelial cells on osteogenic differentiation of noncontact co-cultured periodontal ligament stem cells under hypoxia.［J］.J Periodontal Res，2013，48（1）：52-65.

［11］Lou Y L，Guo F，Liu F，et al.miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia［J］.Mol Cell Biochem，2012，370（1-2）：45-51.

［12］Chae H S，Park H J，Hwang H R，et al.The effect of antioxidants on the production of pro-inflammatory cytokines and orthodontic tooth movement［J］.Mol Cells，2011，32（2）：189-96.

［13］Hanioka T，Tanaka M，Takaya K，et al.Association of oxygen tension in human periodontal pockets with gingival inflammation［J］. J Periodontol，2000，71（4）：550-4.

［14］Mohyeldin A，Garzon-Muvdi T，Quinones-Hinojosa A.Oxygen in stem cell biology：a critical component of the stem cell niche［J］. Cell Stem Cell，2010，7（2）：150-61.

［15］Huang G T，Gronthos S，Shi S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.those from other sources：their biology and role in regenerative medicine［J］.J Dent Res，2009，88（9）：792 -806.

［16］Lee S H，Lee Y J，Song C H，et al.Role of FAK phosphorylation in hypoxia-induced hMSCS migration：involvement of VEGF as well as MAPKS and eNOS pathways［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，298（4）：C847-56.

Effects of hypoxia on the osteogenic differentiation of PDLSCs

Liu Yanzhao，Sun Shilin，Gu Kuang，et al
（Stomatology College of Anhui Medical University，Affiliated Stomatological Hospital of Anhui Medical University，Key Laboratory of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To investigate the effects of the hypoxia on the osteogenic differentiation of the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）.Methods The PDLSCs were cultured under hypoxia and normal condition. Cells in the hypoxia group were incubated in 2%O2for 6，12，24，48 h，and then ALP activity analysis was used to analyze the relative ALP activity.The expressions of OCN，Hif-1α，ALP，Runx-2 mRNA were detected by QPCR，while Western blot was used to analyze the expressions of Runx-2，Hif-1α protein.Results The osteogenic differentiation of PDLSCs under hypoxia condition was higher than the osteogenic differentiation of PDLSCs cultured under nomoxia condition，however，the osteogenic differentiation of PDLSCs cultured under hypoxia condition for 48 h was inhibited.Conclusion Hypoxia can enhance the osteogenic differentiation of PDLSCs within 48 h，however，inhibit the osteogenic differentiation of PDLSCs after 48 h.

human periodontal ligament stem cells；hypoxia；osteogenic

R 329.24；R 781.2

A

1000-1492（2016）07-0965-05

2016-03-04接收

国家自然科学基金（编号：81271162）；安徽省科技攻关计划项目（编号：1401045013）

安徽医科大学口腔医学院、安徽医科大学附属口腔医院、安徽省口腔疾病研究中心实验室，合肥 230032

刘衍钊，男，硕士研究生；王元银，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：wyy1970548@sohu.com；邹多宏，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：zouduohongyy@163.com