重楼总苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移的影响

2016-09-12 04:01苏菲菲卢木娣曾惠红江文良赖文娟梁堂钰赖雪燕龙剑文
安徽医科大学学报 2016年7期
关键词:总苷重楼皂苷

苏菲菲,卢木娣,曾惠红,江文良,赖文娟,梁堂钰,赖雪燕,龙剑文



重楼总苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移的影响

苏菲菲1,卢木娣1,曾惠红1,江文良1,赖文娟1,梁堂钰1,赖雪燕1,龙剑文2

目的 探讨重楼总苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)增生、迁移的影响。方法 MMT法检测重楼总苷Ⅰ对ARPE-19细胞增殖的影响,Transwell小室实验检测ARPE-19细胞侵袭能力的变化,划痕实验检测ARPE-19细胞迁移能力的变化,实时荧光定量PCR检测ERK1/2 mRNA的表达,Western blot法检测ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达水平。结果 重楼总苷Ⅰ可抑制ARPE-19细胞的增生、侵袭、迁移,下调p-ERK1/2蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.01),但对总ERK1/2表达、ERKl mRNA和ERK2 mRNA表达无明显影响。结论 重楼总苷Ⅰ能有效抑制ARPE-19细胞的增殖、侵袭、迁移,可能与重楼总苷Ⅰ抑制了ARPE-19细胞ERK1/2蛋白磷酸化有关,为中药重楼治疗增生性玻璃体视网膜疾病提供了依据。

重楼总苷Ⅰ;增殖;迁移;视网膜色素上皮细胞

网络出版时间:2016-6-6 13:52:32 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.016.html

人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增生、迁移,细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)异常沉积,形成有收缩能力的增生膜,是增生性玻璃体视网膜疾病(PVR)发生和发展的重要环节[1]。研究[2]表明,RPE细胞在PVR的发展中起着最重要的作用。重楼是中医治疗PVR的常用药物之一[3],研究[4-6]表明,其有效成分重楼总苷Ⅰ对一些肿瘤细胞有抑制作用,但对人RPE细胞作用如何,目前暂无报道。该研究观察了重楼总苷Ⅰ对人RPE细胞增生、迁移的影响,以及对其ERK1/2 mRNA表达、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达的影响,探讨重楼总苷Ⅰ治疗PVR的可能机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 重楼皂苷Ⅰ粉剂购自中国药品生物制品检定所;人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)细胞株购自武汉大学细胞库中国典型培养物保藏中心;100 U/L青霉素、100 μg/L链霉素、MTT试剂盒购自武汉博士德生物公司;DMEM培养基、小牛血清和胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司;分光光度仪购自芬兰Labsystems公司;细胞培养箱(热电3111型)购自美国热电公司;TRIzol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司;Quantonestep RTPCR Kit购自北京天根生化公司;ERK1/2、p-ERK1/ 2、辣根酶标记抗鼠lgG抗体购自美国Santa Cruz公司;辣根酶标记的β-actin抗体购自上海兴悠生物科技有限公司;ECL试剂盒购自美国Amersham Biosciences公司;Transwell小室购自美国Millipore公司。

1.2MTT法检测不同浓度药物对ARPE-19细胞增生的影响 将ARPE-19细胞以5×104/孔接种于96孔板,每孔接种100 μl,培养液为含有10%小牛血清的DMEM,待细胞长至 60%~70%融合状态时,加入处理因素,每组重楼皂苷Ⅰ终浓度分别为0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml,每组均设6个平行孔,培养24 h后加入20 μl MTT(5 mg/ml),继续培养4 h后加入 DMSO振荡,调零,酶标仪570 nm波长处检测光密度(optical density,OD)值,细胞生长抑制率(IR)=1-OD实验组/OD空白对照组,实验重复3次。

1.3Transwell实验检测重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞侵袭能力的影响 在上室膜表面均匀铺培养基稀释的Matrigel(1∶3),37℃培养箱中放置30 min,Matrigel凝固。再加入200 μl无血清悬浮培养基,轻洗水化基底膜后备用。取对数生长期的ARPE-19细胞常规消化后,加入终浓度为0、1.5、3.0、6.0 μg/ ml重楼皂苷Ⅰ,孵育1 h后,调整浓度为5×105个/ ml,取200 μl细胞悬液加入上室,另取200 μl含20%FBS的培养基放置于 Transwell下室内,每组均设6个复孔,培养48 h后,取出小室,先弃去培养基,棉签擦去位于上室的细胞,PBS漂洗2次,每孔加入10%甲醇溶液固定,再弃甲醇溶液,加入结晶紫染色,弃染色液,蒸馏水洗涤、干燥,显微镜下随机选取5个视野,计数侵袭细胞数,实验独立重复3次。

1.4划痕实验检测低氧对ARPE-19细胞迁移能力的影响 细胞培养,分组同1.3,取单层融合的ARPE-19细胞,用20 μl枪头在细胞层上垂直划线,PBS冲洗3次,去除划下的细胞,培养48 h,显微镜下观察细胞的迁移情况,软件分析并计算平均划痕愈合率。

1.5测定ERK1/2 mRNA表达水平 ARPE-19细胞培养,分组同1.3。设计上、下游引物,ERK1上游引物:5-GAACTCCAAGGGCTATACCAAGT-3,下游引物:5-GGAGGGCAGAGACTGTAGGTAGT-3,产物164 bp;ERK2上游引物:5′-TCCCCATCACAAGAAGACCT-3′,下游引物:5′-AGTCAGCATTTGGGAACAGC-3′,产物 106 bp;GAPDH上游引物:5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′,下游引物:5′-TGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAGAT-3′,GAPDH扩增长度为214 bp。提取ARPE-19细胞总RNA;cDNA合成;取cDNA 1 μl,2.5×RealMasterMix/20×SYBR溶液11.25 μl,上下游引物各1 μl,加无Rnase水,总反应体积25 μl;PCR反应条件为:95℃变性2 min,循环95℃变性15 s,50℃退火30 s,68℃延伸50 s。结果采用ΔCt值法,ΔCt=样品的Ct均值-内参的Ct均值,2-ΔΔCt即某样品初始cDNA的相对量。

1.6Western blot检测 根据预实验结果,加入不同浓度的重楼皂苷Ⅰ(终浓度依次为 0、1.5、3.0、6.0 μg/ml),每个浓度均设6孔。培养48 h,收集培养后的 ARPE-19细胞,提取总蛋白,用BCA法蛋白定量,上样,SDS-PAGE凝胶电泳后,转膜,PBS洗膜,5%脱脂牛奶封闭1 h;PBS洗膜后加入一抗,4℃过夜;PBS洗膜;加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育0.5 h;洗膜;用增强化学发光试剂盒检测。结果扫描后,用Quantity one图像分析软件光密度分析,以β-actin为内参校正。

1.7统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析,组间均数比较采用t检验,多组间数据比较采用重复测量设计的单因素方差分析。

2 结果

2.1MTT法检测重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的生长活性的影响 培养24 h后,6.0 μg/ml组(t= 23.317,P=0.000)、3.0 μg/ml组(t=16.266,P= 0.000)、1.5 μg/ml组(t=8.012,P=0.000)与0.75 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义;3.0 μg/ ml组(t=8.442,P=0.000)、1.5 μg/ml组(t= 15.224,P=0.000)与6.0 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义。表明重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的生长有抑制作用,其作用有浓度依赖性(F= 187.601,P=0.000)。见图1。

图1 MTT法检测重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞增殖的影响

2.2重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞侵袭能力的影响

培养48 h后,与空白对照组比较,6.0 μg/ml组(t =14.221,P=0.000)、3.0 μg/ml组(t=8.754,P= 0.000)、1.5 μg/ml组(t=5.176,P=0.000)侵袭细胞数差异均有统计学意义;3.0 μg/ml组(t=7.537,P=0.000)、1.5 μg/ml组(t=11.507,P=0.000)与6.0 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义。表明重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的侵袭能力有抑制作用,其作用呈浓度依赖性(F=75.733,P= 0.000)。见图2。

图2 重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞侵袭能力的影响×40

2.3重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞迁移能力的影响培养48 h后,与空白对照组比较,6.0 μg/ml组(t =28.853,P=0.000)、3.0 μg/ml组(t=18.804,P =0.000)、1.5 μg/ml组(t=10.860,P=0.000)划痕愈合率差异均有统计学意义;3.0 μg/ml组(t= 8.089,P=0.000)、1.5 μg/ml组(t=18.269,P= 0.000)与6.0 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义。表明重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的迁移能力有抑制作用,其作用呈浓度依赖性(F=281.005,P=0.000)。见图3。

2.4重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达的影响 重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达无明显影响。与空白对照组比较,6.0 μg/ml组(t=2.127,P=0.059)、3.0 μg/ml组(t= 2.041,P=0.069)、1.5 μg/ml组(t=2.095,P= 0.063)重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1 mRNA表达无明显影响。与空白对照组比较,6.0 μg/ml组(t=1.236,P=0.245)、3.0 μg/ml组(t=0.246,P=0.811)、1.5 μg/ml组(t=0.320,P=0.755)重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞 ERK2 mRNA表达均无明显影响。见图4。

图3 重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞迁移能力的影响×40

2.5重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响 重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2蛋白表达无明显影响,但对p-ERK1/2蛋白表达有明显抑制作用。与空白对照组比较,6.0 μg/ml组(t=20.549,P=0.000)、3.0 μg/ml组(t= 15.386,P=0.000)和1.5 μg/ml组(t=8.647,P= 0.000)重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞p-ERK1/2蛋白表达有明显抑制作用。与空白对照组比较,6.0 μg/ ml组(t=2.170,P=0.055)、3.0 μg/ml组(t= 0.447,P=0.664)和1.5 μg/ml组(t=0.935,P= 0.372)重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2蛋白表达无明显影响。见图5。

图4 重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞 ERK1/2 mRNA表达的影响

3 讨论

PVR是多种细胞及细胞因子参与的对眼内损伤的过度修复反应[7]。人RPE细胞的增生、迁移是PVR发病的早期组织病理学机制。RPE细胞在PVR的发展中起着决定性的作用。抑制RPE细胞迁移、增生是治疗 PVR的方向之一。体外培养的RPE细胞(ARPE-19)有活体内RPE细胞所特有的结构和功能特点,可用于各种体外实验[8],因此本研究选择ARPE-19细胞作为实验对象。

随着重楼皂苷Ⅰ增高,对ARPE-19细胞IR逐渐提高,提示重楼皂苷Ⅰ有抑制ARPE-19细胞增殖的活性。此外,通过划痕试验和Transwell试验分别检测了重楼皂苷Ⅰ对RPE细胞横向和纵向迁移的影响。因为PVR的本质是机体对损伤的过度修复。在PVR中,由于受到各种细胞因子的影响,视网膜色素上皮细胞除了水平方向运动外,纵向侵袭也是视网膜前、下增生膜形成的重要原因。结果表明,重楼皂苷Ⅰ明显抑制了ARPE-19细胞的侵袭和迁移。

图5 重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞 ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响

目前就重楼皂苷Ⅰ抑制ARPE-19细胞增殖、侵袭和迁移的机制还不清楚。重楼活性单体能通过抑制ERK的磷酸化抑制结肠癌SW620细胞的增殖[9]。ERK也被称为丝裂原激活的MAPK通路,研究[10]显示,只有磷酸化的ERK才可以进入细胞核内,促进c-Fos与c-Jun等转录因子的磷酸化,参与ERK通路下游的一系列的激活反应。ERK主要参与细胞分化或增殖,促进细胞生存[11],ERK1/2 MAPK通路阻断可抑制胃癌、乳腺癌等细胞凋亡、促进细胞侵袭,并且抑制miR-21及其靶基因表达[12-14]。本研究检测了不同浓度重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达以及对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响。结果表明,重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达以及对ERK1/2蛋白表达并无明显影响。重楼皂苷Ⅰ可能主要通过下调ERK1/2磷酸化的程度,从而抑制了ARPE-19细胞增殖,侵袭和迁移。

综上所述,本研究结果显示重楼皂苷Ⅰ能够抑制人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移,这可能与其抑制ERK1/2的磷酸化有关。这为中药重楼治疗PVR提供了一定的依据。

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Effects of PolyphyllinⅠ on proliferation and migration of human retinal epithelial cells line ARPE-19

Su Feifei,Lu Mudi,Zeng Huihong,et al
(Dept of Ophthalmology,Hezhou Renmin Hospital,Hezhou 542899)

Objective To study the effects of PolyphyllinⅠ on the proliferation and migration of human retinal pigment epithelial cell ARPE-19.Methods MTT assay was performed to investigate the effect of Polyphyllin I on the proliferation of ARPE-19 cells.Invasion ability of ARPE-19 cells was determined by a Matrigel invasion assay. Migration ability of ARPE-19 cells was determined by a wound healing assay.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to detect ERK1/2 mRNA expression.Western blot was used to detect the expression of ERK1/2,p-ERK1/2.Results PolyphyllinⅠinhibited proliferation of ARPE-19 cells in a dose dependent manner(P<0.01).PolyphyllinⅠtreatment reduced migration and invasion capacity of ARPE-19 cells (P<0.01).PolyphyllinⅠ treatment has no effect on the ERK1/2 mRNA and ERK1/2 protein expression in ARPE-19 cells,but p-ERK1/2 protein expression was markedly decreased by treatment with PolyphyllinⅠ(P<0.01).Conclusion PolyphyllinⅠcan effectively inhibit the ARPE-19 cells proliferation and migration,it may be related to inhibition of the phosphorylation of ERK1/2 in ARPE-19 cells.This study provides some evidences for the efficacy of paradis in the treatment of proliferative vitreoretinopathy.

PolyphyllinⅠ;proliferation;migration;retinal pigment epithelial cells

R 774.1

A

1000-1492(2016)07-0956-05

2015-04-13接收

湖北省卫生计生委中医药、中西医结合科研指导性项目(编号:2013Z-B05)

1贺州市人民医院眼科,贺州 5428992湖北省中医院、湖北中医药大学临床医学院,武汉430061

苏菲菲,女,硕士,责任作者,E-mail:984625812@qq.com

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