介质膜结构空芯光纤酶基传感器的制作与优化

何宇婧，陈 盼，朱晓松，汤晓黎，石艺尉



介质膜结构空芯光纤酶基传感器的制作与优化

何宇婧，陈 盼，朱晓松，汤晓黎，石艺尉

( 复旦大学 通信科学与工程系，上海 200433 )

设计了一种基于介质膜结构的空芯光纤化学发光传感器。建立了多层膜空芯光纤非子午线几何光学传输模型，对其损耗谱和发光特性进行了仿真分析，并考虑了介质膜界面粗糙度、介质膜厚度等相关参数对化学发光及传输特性的影响。改进了溶胶-凝胶酶基敏感膜的制作工艺，提出了分离镀膜法，并对敏感膜厚度进行了实测分析。搭建了基于介质膜空芯光纤化学发光传感器的检测系统，对过氧化氢浓度进行了实际测量。结果表明，基于本传感器的系统，得到了22.8 nW/(mmol·L-1)的灵敏度以及3 μmol/L的检测极限。实现了近200 h的使用寿命。且操作简单，反应快速，可小型化，可应用于环境监测，生物分析等领域。

生物传感器；多层膜空芯光纤；化学发光；酶；溶胶-凝胶法

0 引 言

光纤生物传感器(Optical Fiber-based Biosensors，OFB)是采用光纤或光纤束作为传感检测平台的一种生物传感器，大致可以分为以下几类[1-2]。酶基生物传感器、抗体免疫检测光纤生物传感器、核酸光纤生物传感器、全细胞光纤生物传感器和仿生学生物光纤传感器。其中，酶基光纤生物传感器是常见诸报道的光纤生物传感器[3-5]，典型的光学检测方法有吸收、反射、荧光、化学发光等。其中，化学发光(Chemiluminescence，CL)具有灵敏度高，检测极限低，线性范围宽和分析速度快等优点，成为一种非常有潜力的分析方法。其检测设备简便、系统易于搭建，并且无需激励光源，因而也无需附加装置来消除光源散射影响，背景噪声大大降低，使其相对于传统吸收、反射、荧光光谱等检测方法在选择性和灵敏度上有明显的优势[6]。

在酶基化学发光传感系统中，作为重要催化剂的生物酶，其固定化的方式相较于游离酶在稳定性以及可重复使用等方面具有明显优势[7-8]。固定化酶有多种方法，其中采用溶胶-凝胶(Sol-gel)包埋法是近年来常见的一种快速固定化酶的方法[9-13]。由于溶胶-凝胶是一种透明并且具有化学惰性的材料，反应条件温和，凝胶介孔不会影响生物分子官能团的活性，因此能够提供稳定的结构以包埋生物酶分子[9-16]。已报道的大部分酶基化学发光传感器的制作都是将催化酶溶胶凝胶涂制于透明的玻璃、比色皿等内部，导入反应剂后直接检测其产生的荧光。但受限于传感器的长度和结构，其耦合效率和传输效率较低。Ramos等人则将生物酶固定在石英光纤端部进行化学发光的检测[17]，但无法避免室内杂光的影响，使得背景光源掩盖了微弱的荧光信号，难以获得较好的灵敏度。我们在前期研究中[18]，利用空芯光纤(Hollow Fiber, HF)作为传感腔和光传导介质，提出了包埋酶的化学发光传感器。

然而基于金属结构空芯光纤传感器(Metallic Hollow Fiber-based CL Sensor，M-HF CL Sensor)仍然存在一些问题，比如，凝胶引起的金属膜皱缩，显著地影响了传感器的使用寿命；凝胶敏感膜厚度的不确定性影响了化学发光的传输效率的优化；磷酸盐缓冲液的使用虽然加快了凝胶成膜过程，但过快的缩合速度，对镀膜时间有了严格限制，也就是对凝胶敏感膜厚度有了一定的限制。

为了降低M-HF CL传感器的传输损耗，提高灵敏度和稳定性，增加使用寿命，本文设计了一种基于介质膜结构的空芯光纤化学发光传感器(Dielectric/metallic Hollow Fiber-based CL Sensor，D-HF CL Sensor)，并对其损耗谱特性进行了理论分析，同时考虑了介质膜界面粗糙度、介质膜厚度、折射率等相关参数对化学发光传输特性的影响，得到了两层膜空芯光纤非子午线几何光学传输模型。

通过对数值仿真和实测结果的分析，可以在制作工艺过程中判断各层膜厚，从而为调整工艺参数和控制各层膜厚提供依据。在仿真结果的指导下，我们以内径0.7 mm的玻璃毛细管作为基管材料，采用改良的液相镀膜法降低膜的表面粗糙度，制作了Ag/OC300/SiO2结构的介质膜空芯光纤化学发光传感器。最后，基于鲁米诺(Luminol)－过氧化氢(H2O2)－辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)发光体系搭建了检测系统，制作了不同厚度的介质膜结构空芯光纤化学发光传感器，并对H2O2进行了定量分析，得到了22.8 nW/(mmol·L-1)的灵敏度以及3 μmol/L的检测极限。

1 化学发光检测系统

1.1 化学发光传感器结构

介质膜空芯光纤传感器结构如图1所示。最外层是由玻璃毛细管构成的基管，作为光纤的机械支撑。基管内壁第一层是均匀银膜，实现光的高反射率；第二层是玻璃质多聚合物，用于优化传感头的传输特性；第三层是包埋辣根过氧化物酶(HRP)的多孔二氧化硅敏感膜，即形成空芯光纤生物传感腔。基管内壁第一层的银膜采用改良的液相镀膜法镀制，实现具有一定厚度的均匀光学反射膜；银膜内壁的介质膜则采用了玻璃质多聚合物(R2SiO)OC300进行镀制，通过调节膜厚来实现目标波长的低损耗传输[19]。最内层则是采用Sol-gel分离镀膜法制作的包埋HRP的多孔二氧化硅敏感膜[18, 20]。

图1 介质膜结构空芯光纤化学发光传感器结构图

第二层OC300介质膜除了对于银膜具有保护作用外，与第三层包埋HRP的多孔二氧化硅敏感膜之间可以形成Si-O-Si化学键，增强了膜的附着力，相较于金属结构空芯光纤传感器可以显著地延长使用寿命。该介质膜在室温下即可完成制备，主剂、稀释剂、硬化剂混合而成的OC300溶液由蠕动泵送液，匀速通过镀银空芯光纤即可生成介质膜。在制备过程中通过调节溶液浓度、温度、蠕动泵流速等因素，可以实现对

膜厚的控制

[21-25]

。

图2 基于介质膜空芯光纤传感器的化学发光检测系统

1.2 化学发光检测系统

如图2所示，待测H2O2和Luminol混合后，再由蠕动泵抽送至介质膜空芯光纤传感器一端，而传感器另一端固定一个带有透明窗片的L型二通元件。待测样液接触传感器内壁酶基敏感膜，在敏感膜包埋的HRP催化下发出中心波长为425 nm的蓝色荧光。蓝色荧光透过窗片被光功率计检测头接收。同时废液通过二通元件排出，这样既保持了检测器内待测样液流动的稳定性，也避免了光学元器件被污染。检测器采用以色列Ophir公司的PD-300UV+Nova II光功率计，可检测的波长范围为200 nm ~1 100 nm。

2 理论建模与仿真优化

2.1 传感器传输模型

空芯光纤的内径大致在一百到几百微米。对于化学发光检测系统，传输的目标波长远小于波导尺寸，因此可以采用几何光学法[26-27]建模分析多层膜空芯光纤的光谱特性，并进行介质膜的膜厚以及化学发光传感中各项参数的优化计算。

在空芯光纤化学发光传感器中，考虑到空芯光纤内部各处均可被酶基敏感膜催化产生化学发光，它们分别沿着传输方向叠加累积同时也产生传输损耗，并且光纤内化学发光的全向性也使得其不再满足子午光线近似条件，等效于光线螺旋式前进传输[18]。因此建立了多层膜非子午线几何传输模型，对传感器的优化进行仿真分析。斜光线入射示意图如图3。由几何关系可得：

其单位长度的光程和反射次数分别为

则传输衰减常数为

图3 斜光线入射角度示意图

假设传感器内部酶基敏感膜催化激发的化学发光均匀，可将其看作在立体角上均匀发光，单位立体角上发光功率为0/4p。由立体几何关系可得输出光功率：

图4(a)为化学发光传感器在发光波段的损耗谱仿真结果，分别对应介质膜和金属膜两种结构的空芯光纤CL传感器。空芯光纤长度均为8 cm，孔径均为700 μm。敏感膜折射率经过阿贝折射仪实测为1.361，

图4 (a) 金属结构和介质膜结构空芯光纤化学发光传感器在发光波段的损耗谱特性；(b) 介质膜(OC300)厚度与化学发光强度的关系

OC300介质膜折射率根据文献[28]取值为1.46。可以看出，D-HF CL传感器在425 nm的发光波段相较于M-HF CL传感器的传输损耗更低，并且可以通过调节介质膜厚度来改变低损传输的波段范围。图4(a)中实线为M-HF CL传感器在不同波段的传输损耗谱，虚线由左到右分别为OC300介质膜厚340 nm，360 nm，380 nm的D-HF CL传感器。可以看出，360 nm介质膜厚度的传感器在425 nm的发光波段传输损耗最低。

图4(b)则模拟了不同OC300介质膜厚度的D-HF CL传感器的化学发光强度，虚线代表了M-HF CL传感器的发光强度，即OC300介质膜厚度为0的情况。同时考虑了介质膜的吸收和介质膜与银膜之间的粗糙度。由图4(b)可以看出，OC300介质膜在258 nm~385 nm的膜厚范围内，传输损耗均小于M-HF CL传感器。由于实验中选择了350 nm厚度OC300介质膜，之后的理论计算中，均取该参数进行仿真。

2.2 传感器的长度优化

图5(a)给出了不同内径的D-HF CL传感器长度与化学发光强度的关系。实线和虚线分别为介质膜空芯光纤传感器(D-HF CL sensor)和金属结构空芯光纤传感器(M-HF CL sensor)。图5(b)给出了700 μm内径的两种结构传感器更为清晰的比较图。在优化OC300介质膜膜厚的基础上，镀制酶基敏感膜，可以降低非子午线模型化学发光的传输损耗。可以看到相同长度和内径条件下D-HF CL传感器得到的化学发光光强更大。

从图5可以看出，化学发光信号强度随着光纤长度增加而加大。但随着光纤长度继续增加，酶促反应释放的荧光在传输过程中损耗殆尽，因而存在荧光信号强度的极限值。另一方面内径越大，损耗越低，因此输出荧光信号强度越大。取出射光强达到最大值90%时的传感器长度为最优长度，可以看出，最优长度也随着内径的增大而增大。只要传感器长度大于最优长度便可使化学光强接近最强。理论仿真结果可以看到，700 μm内径的D-HF CL传感器的最优长度为8 cm。在传感器的实际制作中，选取该长度。

同时，D-HF CL传感器的最优长度相对于M-HF CL传感器的最优长度有了一定提高。主要是介质膜降低了传输衰减，使单位长度内光强增量增加。故其达到饱和发光状态的最优长度增加。对于较小内径空芯光纤传感器，最优长度的增加不明显。可以说介质膜对较大孔径HF CL传感器最优长度的影响更明显。

图5 (a) 不同内径下化学发光强度与传感器长度的关系；(b) 700 μm内径D-HF CL传感器化学发光强度与传感器长度的关系

2.3 粗糙度的影响

在实际制作空芯光纤传感器时，薄膜表面的粗糙度难以避免。理论上，各层膜表面粗糙度越大，则附加损耗越大。通过对光在两种介质分界面处的反射模型中计入散射的波矢进行修正[21,25,29]，进而对粗糙度引起的附加损耗进行仿真研究。图6分别为1 mm和700 μm内径D-HF CL传感器在不同粗糙度条件下，化学发光强度和最优长度的关系。对于相同孔径传感器，由上到下的曲线代表粗糙度分别取50 nm、60 nm、70 nm的不同情况。可以看出粗糙度越大，最优长度越短。同时，粗糙度对于较大孔径HF CL传感器的最优长度影响更明显，即较大孔径传感器在不同粗糙度影响下，最优长度的变化范围更大。

图6 不同粗糙度条件下，化学发光强度与传感器长度的关系

3 实验及制作参数优化

3.1 酶基敏感膜的制作

溶胶-凝胶储备液的制备参考文献[18]，将1 mg辣根过氧化物酶(酶活力不小于250 U/mg)溶于0.5 mL PH=6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中备用。在已有的文献中，都是将Sol-gel储备液和溶有HRP的缓冲液混合搅拌后，进行镀膜工艺。在室温的条件下混合后的溶胶凝胶溶液凝固时间大致为50 s到120 s，若要在如此短的Sol-gel储备液凝固时间内完成酶基敏感膜的镀制，只能通过加快送液速度来实现。但对于孔径较大、最优长度较长的传感器来说，速度过快，则敏感膜的膜厚和粗糙度显著增加，造成传感器性能的下降。

基于以上原因，本文在实际制作过程中，提出并采用了分离镀膜法。其制作流程如图7所示。将溶胶-凝胶储备液和溶有HRP的PBS缓冲液分离放置，首先打开开关1，使溶胶-凝胶溶液自下而上地匀速通过，保证光纤内壁能够均匀黏着。接着关闭开关1并打开开关2，让溶有HRP的PBS缓冲液以同样的方式匀速流过。送液结束后，封闭光纤两端，密闭老化一段时间，即完成传感器的制作，使用阿贝折射仪测定包埋HRP的凝胶膜折射率为1.361。

采用分离镀膜法，消除了凝固时间对镀膜过程的限制，同时由于蠕动泵送液速度影响着酶基敏感膜厚度[30]，还可以通过调节两种储备液的流速实现对膜厚的优化。一方面，酶分子浓度固定，膜越厚，则酶分子含量越多，化学发光的强度会有所提高。另一方面，酶基敏感膜厚度越厚，吸收引起的传感器损耗也会变大。本文通过调节两种储备液的流速制作了700 μm内径不同酶基敏感膜厚度的D-HF CL传感器，并实测了相同浓度H2O2在本系统的发光强度。结果如图8所示。

图8(a)是固定溶有HRP的PBS缓冲液流速之后，调节sol-gel 溶液送液速度制作的一系列的D-HF CL传感器的实测光强归一化结果，当sol-gel溶液速度为9.41 cm/min时制作的D-HF CL传感器检测到的固定浓度H2O2的化学发光强度最高。图8(b)是固定sol-gel溶液送液速度之后，改变溶有HRP的PBS缓冲液流速制作的一系列的D-HF CL传感器的实测光强归一化结果，当缓冲液流速为4.50 cm/min时，检测光强最高。经过对损耗谱的实测发现，两种流速下镀制的敏感膜厚度为150 nm，根据仿真结果可知，介质膜厚度为350 nm时，该酶基敏感膜厚度下，化学发光较强。

图7 介质膜结构空芯光纤化学发光传感器 酶基敏感膜镀制系统图

图8 (a) 溶胶凝胶溶液的流速与化学发光强度的关系；(b) 溶有HRP的PBS缓冲液的流速与化学发光强度的关系

3.2 酶基敏感膜的厚度

在单层介质膜空芯光纤结构中，实测损耗谱中的各个干涉峰波长成倍数关系，只要得到某个干涉峰的波长便能计算[23]介质膜膜厚。然而对多层膜结构，已无法套用单层膜估算方法。我们利用光纤损耗谱特性间接估算多层介质膜的膜厚。用一组膜厚值进行仿真，当膜厚值的理论损耗谱曲线和实测损耗谱曲线吻合时，我们便认为该组膜厚值为空芯光纤多层介质膜的厚度。单独测量M-HF CL传感器的损耗谱时，由于酶基敏感膜厚度较薄，无法测到干涉峰，所以镀制一层OC300能很好的计算出敏感膜厚度。

图9 介质膜空芯光纤化学发光传感器损耗谱

根据以上参数设计的传感器的损耗谱如图9所示，根据单层膜膜厚的计算公式和干涉峰位置可以算得D-HF CL传感器制作所采用的空芯光纤OC300介质膜厚度为350 nm，将酶基敏感膜厚度取为150 nm时带入多层膜损耗谱计算模型，理论计算和实验测量结果在可见光区域的低损耗窗口位置一致。

4 实验结果与讨论

4.1 系统其它参数

在仿真分析优化传感器设计的基础上，为了进一步提高HF CL传感系统的性能，还实测了待测液进液速度、PH值以及Luminol浓度值等三项影响输出光功率的参数。首先固定待测反应剂浓度和进液速度(2.5 cm/min)。由于本系统中未添加任何化学发光增强剂，所以PH的选择极为重要，甚至影响整个系统的灵敏度。辣根过氧化物酶(HRP)的活性最佳PH值在6.5~7之间，而Luminol在碱性条件下(PH值10~11)的量子产率最大，因此取少量NaOH和PBS缓冲液调节PH，进行固定反应剂浓度的化学发光实测，确定了PH值取8.5时，化学发光信号强度最大。并在该PH值下以同样的单一变量法确定了Luminol浓度为2.5 mmol/L。

4.2 实测结果

为了验证仿真模型的可靠性，实际制作了两组OC300介质膜厚度均为350 nm的D-HF CL传感器，对固定浓度的反应剂进行了化学发光的检测——采用内径均为700 μm，长度分别为2 cm、5 cm、6 cm、7 cm和8 cm的D-HF CL传感器，得到的实测结果如图10(a)。采用长度均为8 cm，内径分别为200 μm、320 μm、540 μm、700 μm的D-HF CL传感器得到的实测结果如图10(b)。实测值与理论曲线的趋势吻合，说明利用该模型可以比较准确地反映相关参数的影响。

图10 (a) 不同长度介质膜HF-CL传感器化学发光理论曲线与实测值；(b) 不同孔径介质膜HF-CL传感器化学发光理论曲线与实测值

为了比较介质膜结构和金属结构这两种HF CL传感器的性能，分别实测了两种传感器在相同过氧化氢浓度(0.05 mmol/L)下的化学发光强度，结果如图11所示——本文设计的D-HF CL传感器(Ag/OC300/sol-gel with HRP)实测到的发光强度最大，较弱的光谱曲线是传统的M-HF CL传感器(Ag/sol-gel with HRP)的实测结果。其中D-HF CL传感器的OC300介质膜厚度为350 nm，两种传感器的酶基敏感膜厚度均为150 nm。由图可见，在相同浓度H2O2下，D-HF CL传感器测得的化学发光更强。最下面的光谱曲线则是用OC300包埋HRP形成酶基敏感膜的实测结果，可见由于结构致密，无法让生物酶分子与待测反应剂接触，基本没有产生发光。

由于OC300介质膜对酶基敏感膜具有更好的黏附性，使得D-HF CL传感器的稳定性更好，化学发光更强——在相同浓度反应剂下经过多次测量后继续使用，得到的光信号强度依然能达到最高测量值的95%以上。而经过多次测量使用的M-HF CL传感器对相同浓度反应剂的检测强度则降为测量最高值的42.6%。这主要是因为银膜对酶基敏感膜的粘附力不强，导致银膜由于多次测量产生了皱缩，从而降低了传感器的使用寿命。如图12所示，(a)、(b)分别为700 μm内径的M-HF CL传感器和D-HF CL传感器，(c)、(d)分别是内径为1 mm的M-HF CL传感器和D-HF CL传感器。可以明显观察到M-HF CL传感器的银膜脱落现象。实验结果还显示，老化时间在三天以内的传感器性能稳定，老化时间超过10天传感器性能明显下降。

4.3 过氧化氢浓度标定

4.3 过氧化氢浓度标定采用D-HF CL传感器对范围在1 mmol/L~7 mmol/L的过氧化氢浓度进行了标定，其化学发光检测结果与拟合曲线如图13。对过氧化氢浓度范围在1 mmol/L~7 mmol/L的实测发光强度数据进行拟合，得到方程为=22.81-18.206，相关系数为0.991。说明D-HF CL传感器对H2O2浓度的响应较好，发光信号可以作为其浓度的表征量，且检测过程中未添加任何增强剂，灵敏度为22.8 nW/mmol。对摩尔浓度为5 mmol/L的的过氧化氢样品重复测量5次，RSD为±2.06%，重复性较好。

由式(7)可以看出，相较于M-HF CL传感器，D-HF CL传感器的最优长度较大有效地提高了H2O2定量检测系统的灵敏度。而对于相同长度的D-HF CL传感器，介质膜厚度不同则传感器的衰减系数不同，进而表现为灵敏度的不同。图14给出了两种不同介质膜厚度的空芯光纤CL传感器的检测结果，两根曲线分别为介质膜膜厚为350 nm和487 nm空芯光纤传感器的定量拟合结果。可以看出350 nm空芯光纤CL传感器的灵敏度更高。通过计算也可以得到350 nm D-HF CL传感器在纤芯充满待测液的条件下衰减系数较低。由此可见在长度、敏感膜厚度、酶含量均相同的条件下，350 nm介质膜厚灵敏度更高。

5 结 论

设计了基于介质膜空芯光纤的化学发光传感器，并改进了溶胶凝胶法对酶基敏感膜的制作工艺，提出了分离镀膜法，从而解决了多次测量引起空芯光纤金属膜皱缩的问题，大幅提高了传感器使用寿命，使其性能在200 h内保持良好。同时建立了多层膜空芯光纤非子午线几何光学传输模型，并对不同长度和内径的传感器进行了实测，验证了该模型的可靠性。通过理论仿真进一步探讨了相关参数对发光强度的影响，为实验设计提供了重要参考。根据理论指导给出的最优化参数，制作了不同介质膜厚度的传感器，并进行了系统响应研究，得到不同浓度范围内关于过氧化氢浓度的标定曲线。同时也分析和实测了介质膜厚度对化学发光传输特性的影响，结果表明通过对介质膜厚度的优化设计，可以进一步提高传感器的灵敏度以及检测极限。

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Fabrication and Optimization of Enzyme Biosensors Based on Hollow Fiber with Dielectric Film

HE Yujing，CHEN Pan，ZHU Xiaosong，TANG Xiaoli，SHI Yiwei

( School of Information Science and Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China )

A chemiluminescence sensor is proposed based on the dielectric coated silver hollow fiber. A ray optics model is established for the multi-layer hollow fiber to analyze the loss spectrum and chemiluminescent characteristics. And parameters such as film surface roughness and thickness are taken into consideration. The fabrication techniques for coating sol-gel sensing film inside the hollow fiber are developed. A sensing system is designed and established for detecting hydrogen peroxide concentration and a high sensitivity (22.8 nW/(mmol·L-1)) and good detection limit (3 μmol/L) are achieved. This sensor has a good performance in 200 hours. It has potential applications in environmental monitoring and biological analysis fields for its simple operation, fast response, and miniaturization.

biosensors; multi-layer hollow fiber; chemiluminescence; enzyme; sol-gel

1003-501X(2016)08-0018-09

TP212.3

A

10.3969/j.issn.1003-501X.2016.08.004

2015-07-17；

2015-12-11

国家自然科学基金(61201062)；上海市自然科学基金(15ZR1404100)资助项目

何宇婧(1988-)，女(蒙古族)，上海人。硕士研究生，主要从事空芯波导生物传感器的应用研究。E-mail: 11110720014@fudan.edu.cn。