分子印迹固相萃取超高效液相荧光法测定螺类中多环芳烃

胡　园，郑伊诺，陆荣茂，许凯伦，曾国权，黄建东，潘齐存（浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室，浙江温州 325005）

分子印迹固相萃取超高效液相荧光法测定螺类中多环芳烃

胡园，郑伊诺，陆荣茂，许凯伦，曾国权，黄建东，潘齐存
（浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室，浙江温州 325005）

建立分子印迹固相萃取结合超高效液相荧光法测定螺类中15种多环芳烃的方法。样品经正己烷提取，用MIP-PAHs多环芳烃专用固相萃取小柱（SPE）净化，荧光检测器定量检测。15种多环芳烃在方法线性范围为1～100 ng·m L-1，相关系数大于0.999，在不同的添加水平（5、10、20μg·kg-1）下，PAHs各组分的平均回收率在73.07%～108.06%，相对标准偏差为0.6%～9.2%。检测浙江省内部分地区螺类中15种PAHs总含量值范围为17.20～107.26μg·kg-1，螺类样品的PAHs优势组分为三环结构，六环结构的PAHs未检出。

分子印迹固相萃取；超高效液相荧光法；多环芳烃；螺类

文献著录格式：胡园，郑伊诺，陆荣茂，等.分子印迹固相萃取超高效液相荧光法测定螺类中多环芳烃［J］.浙江农业科学，2016，57（7）：1137-1140，1155.

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）类化合物是一种惰性较强的碳氢化合物。PAHs具有疏水性、半挥发性及难降解等特点，容易在生物体内富集［1-3］。PAHs能够抑制植物的生长，对人类有明显的“三致”效应（致癌、致畸、致突变），已成为世界的研究热点［4-5］。由于我国工业化及城市化的快速发展，燃煤、燃油被广泛地应用，产生的污染物不断排入水域中，对渔业养殖带来很大的危害，并影响到水产品的出口和我国人民的身体健康。

贝螺类具有营滤食性生活和代谢率低的特点，极易富集污染物，常用作海洋生态系统污染暴露于效应的生物指示。PAHs在环境中不易降解并且具有亲脂特性，经鳃丝、体表渗透和摄食等方式进入海洋生物，环境中PAHs的生物富集系数可高达几千至几百万倍，因此海洋贝螺类已广泛地应用于海洋环境中有机污染物的检测［6-7］。

分子印迹技术是借助人工制备的分子印迹聚合物（molecu1arly imprinted polymer，MIP）针对目标分子实施特异性识别、分离、净化以及富集处理，同时多种MIP和SPE柱结合起来的应用，通过分子印迹材料能够避免到内源性干扰，在有效去除样品基质干扰的同时，还可以特异性结合分析物［8］。本研究利用分子印迹固相萃取-超高效液相荧光色谱法测定螺类中多环芳烃的含量，并综合分析浙江省内部分地区螺类体内PAHs的残留现状、含量水平及PAHs的组分特征。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

H-CLASS型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；MG-2200型氮吹仪（日本EYELA公司）；QT-1型漩涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；12位固相萃取真空装置（德国CNW科技公司）；SB-5200DT型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5810R型离心机（德国Eppendorf公司）；电子天平（德国bt25s公司）；MIP-PAHs多环芳烃专用小柱（上海安谱科技股份有限公司），填料规格为1 g·（6 m L）-1；亲脂PTFE针式滤器。

乙腈（色谱纯），正己烷（色谱纯），二氯甲烷（色谱纯）；15种多环芳烃混合标液：萘（Nap）、苊（Ace）、芴（F1u）、菲（Phe）、蒽（Ant）、荧蒽（F1n）、芘（Pyr）、苯并（a）蒽（BaA）、（Chr）、苯并［b］荧蒽（BbF）、苯并［k］荧蒽（BkF）、苯并［a］芘（BaP）、茚苯［1，2，3-cd］芘（Inp）、二苯并［a，n］蒽（DahA）、苯并［g，h，i］芘（BghiF），浓度为200 mg·L-1。

1.2样品预处理

1.2.1试样提取

称取5 g均质（精确至0.01 g）试样于50 m L离心管A，加入10 m L正己烷，涡旋振荡10 s后，放入40℃超声水浴30 min，4 500 r·m in-1离心5 min，吸取上清液于30 mL玻璃离心管B中，再加入10 m L正己烷重复提取操作一次。合并两次上清液，待净化。

1.2.2试样净化

依次用5 m L二氯甲烷、5 m L正己烷活化M IPPAHs多环芳烃专用小柱，将待净化样上到小柱上，再用2 m L正己烷润洗30 m L玻璃离心管B，上样到柱上，用6 mL正己烷淋洗小柱并弃流出液，再用6 m L二氯甲烷收集洗脱液于5 m L玻璃离心管中，将收集液在40℃下用氮气吹干，用1 m L乙腈定容，超声1 m in，再漩涡混合10 s，过0.22μm亲脂PTFE针式滤器，待上机检测。

1.2.3测定

取试样溶液10μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，从标准曲线上查得样品中多环芳烃的浓度。

1.3色谱条件

色谱柱为Aglient ZORBAX Eclipse PAH柱（4.6 mm×150 mm，3.5μm），柱温30℃；流动相A为乙腈，B为超纯水。洗脱梯度为0.0～2.0 min，50%A；2.0～22.0 m in，50%～100%A；22.0～28.0 min，100%A；28.0～28.1 m in，100%～50%A；28.1～32 m in，50%A；流速为1.5 m L·m in-1。

多波长荧光检测器，采用程序定时控制荧光检测波长变化，测定除苊烯以外的15种多环芳烃，见表1。

1.4结果计算

15种多环芳烃含量的计算公式：

X/（μg·kg-1）=C·V·1000/m。

其中，X为样品的多环芳烃含量，μg·kg-1；C为从标准工作曲线中得到的待测液中多环芳烃的浓度，μg·m L-1；V为待测液体积，m L；m为试样质量，g。

表1　PAHs的荧光检测程序

2　结果与分析

2.1标准曲线线性范围

配置1、5、10、20、50和100 ng·m L-1系列标准工作溶液，以待测物的浓度X（ng·m L-1）为横坐标，待测物的峰面积Y为纵坐标制作标准曲线，得到PAHs的回归方程和相关系数。由表2可知，PAHs在1～100 ng·mL-1其标准曲线的线性关系良好，可满足定量分析的要求。

表2　15种PAHs的线性范围、线性方程、相关系数

2.2回收率与精密度

为了确保分析数据的准确性、精密性和可比性，在空白螺类样品中添加含有15种PAHs的混标（添加水平分别为5、10、20μg·kg-1），每个添加水平进行3次实验，与未加标的样品进行同样的实验操作流程，最终经过色谱分析得到含有混标的样品谱图与没加标的空白样品谱图。从表3可知，5～20μg·kg-1加标水平时，样品15种PAHs的平均加标回收率为73.07%～108.06%；相对标准偏差（RSD）均小于10%。

2.3浙江省内部分地区多环芳烃的含量水平

运用本研究建立的方法对浙江省内部分地区的螺类样品进行分析检测。

检测分析结果（表4）表明：15种组分中Phe的平均含量最高，检测样品中Phe的含量在5.83～30.21μg·kg-1；Nap的平均含量为8.44μg· kg-1；BkF、BaP、BaA、BghiP和InP在被测螺类中均未检出。

表3　PAHs空白样品中的平均加标回收率（n=3）

表4　浙江省部分地区螺类中多环芳烃的含量μg·kg-1

浙江省内部分地区的螺类样品中多环芳烃平均含量见图1。可知，温州洞头被测样品的PAHs总和含量最高，平均含量约为57.02μg·kg-1；其次台州椒江和温州苍南的PAHs含量分别为48.45、41.10μg·kg-1；台州三门和舟山普陀的PAHs平均含量分别为39.28、37.15μg·kg-1。

图1　浙江省内部分地区多环芳烃平均含量

图2　总体组分结构

图3　浙江省内部分地区多环芳烃组分特征

2.4浙江省内部分地区螺类多环芳烃的组分特征分析

PAHs大致可分为2环的萘，3环的苊烯、苊、芴、非和蒽，属于低分子质量多环芳烃，易挥发，对水生生物有一定毒性；4环的荧蒽、芘、苯并［a］蒽和艹屈，5环的苯并［b］荧蒽、苯并［K］荧蒽、苯并［a］芘、二苯并［a，h］蒽，6环的茚并［1，2，3-cd］芘、苯并［g，h，i］苝，属于高分子质量多环芳烃，沸点较高，不易挥发，但具有致癌、致突变作用［9-10］。由图2可知，本研究中螺类的多环芳烃优势组分为3环结构约为47.41%，其次是4环结构为33.75%，6环结构未检出。总的结构比例为3环＞4环＞2环＞5环＞6环。其中，低分子质量（2～4环的PAHs）占总含量的比例为99%以上。

浙江省内部分地区PAHs组分特征见图3。2环PAHs是台州三门和温州洞头被测螺类体内多环芳烃的优势组分；台州椒江被测样品的PAHs以4环为优势组分；舟山普陀的组分特征结构较平均，2、3、4环结构含量在5.41～5.87μg·kg-1；PAHs结构组成较丰富的是温州洞头，4种结构的组分都有。

3　讨论

本研究建立了分子印迹固相萃取-超高效液相色谱荧光检测15种多环芳烃含量的方法，具备了操作步骤简单、回收率稳定、结果准确的优点。超声波提取法增强了溶剂穿透复杂基质，对水产品中PAHs的分析更有优势。PAHs在1～100 ng·m L-1其标准曲线的线性关系良好；在不同的添加水平下，PAHs各组分的平均回收率在73.07%～109.73%，相对标准偏差为0.6%～9.2%。

浙江省内部分地区螺类中15种PAHs总含量约为17.20～107.26μg·kg-1，15种PAHs组分中Phe的平均含量最高，其含量在5.83～30.21μg· kg-1；BkF、BaP、BaA、BghiP和InP在被测螺类中均未检出。其中，温州洞头被测样品的PAHs含量最高，平均含量约为57.02μg·kg-1。

本研究中螺类样品的多环芳烃优势组分为2环结构，而6环结构均未检出。2～4环的PAHs含量占总含量的比例为99%以上。PAHs结构组成较丰富的是温州洞头，4种结构的组分都有。

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（责任编辑：万 晶）

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0528-9017（2016）07-1137-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160757

2016-04-12

海水养殖贝类保活过程中生化特性的研究及其鲜度评价（2015C32037）；飞云江入海口陆源污染对贝类养殖的影响及贝类质量安全风险预警技术研究（2015F30021）；2013年度省级公益性技术应用研究社会发展项目（2013C2059）

胡 园（1988—），女，工程师，硕士研究生，从事水产品质量安全与检测工作，E-mai1：75838180@qq.com。