基于巢式PCR的重叠延伸PCR优化

彭 雷，赵 艳，马银花

(1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001；2.武汉大学生命科学学院，湖北武汉 430072)



基于巢式PCR的重叠延伸PCR优化

彭 雷1，赵 艳2，马银花2

(1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001；2.武汉大学生命科学学院，湖北武汉 430072)

[目的]结合巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。[方法]以褐飞虱Actin1基因启动子区与EGFP表达盒区基因融合为例，通过巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。[结果]成功获得融合片段，经过巢式PCR优化后大大简化试验流程，缩短试验时间，并增强PCR特异性与检出率。[结论]优化了重叠延伸PCR，可更快速高效融合基因片段。

重叠延伸PCR；巢式PCR；褐飞虱；Actin1启动子

重叠延伸PCR(splicing by overlap extensionPCR，SOE-PCR)由Horton 等[1-2]于1989 年创立。重叠延伸PCR是一种通过基因间重叠的部分互相搭桥，通过PCR延伸来扩增出融合基因，被广泛应用于基因定点突变、基因融合等领域[3-4]。巢式PCR(nested PCR)是一种在普通PCR技术上发展而来的技术，其原理为设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测[5]。巢式PCR可大大降低假阳性，同时可使检测的下限下降几个数量级。笔者以褐飞虱Actin1基因启动子区与增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)融合为例，结合巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化，优化后重叠延伸PCR可更快速高效融合基因片段。

1　材料与方法

1.1材料供试褐飞虱饲养在温室，饲养温度为(22～28)℃，光照时间 14 h/d。

1.2试剂pEGFP-N1载体、Top 10感受态细胞为武汉大学杂交水稻重点实验室保存。高保真聚合酶KOD Plus购自Toyobo；PMD18-T Simple Vector、DNA solution I为TaKaRa产品。PCR产物胶回收试剂盒购自Omega。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3褐飞虱DNA提取褐飞虱基因组 DNA 提取皆为单头虫提取，所用方法为 CTAB 法，参照文献[6-7]并略做改动。将采集的单头褐飞虱放入装有400 μL 2%CTAB的1.5 mL离心管中，用匀浆小棒捣碎匀浆；将匀浆液放入60 ℃水浴锅水浴60 min裂解；在裂解完毕后的匀浆液中加入200 μL氯仿/异戊醇(24∶1)抽提2次；加入2倍体积无水乙醇-20 ℃沉淀；最后DNA风干后溶于50 μL TE，于-20 ℃保存备用。

1.4PCR扩增以褐飞虱基因组为模板，引物A1-1与A1down扩增褐飞虱Actin1基因启动子区，A1-1序列：5′-CCTATAAAATGATCATCTATTG-3′；A1down序列：5′-CTTGCTCACCATGTTGATATCCTTTCTTGTTTAGTTAA-3′。A1-1位于Actin1距ATG上游1 031 bp的位置，A1down为下游嵌合引物，位于Actin1 ATG前端侧翼起始位置。以pEGFP-N1载体作为模板，引物EGFPoverlapF与EGFP1扩增EGFP ORF框序列。EGFPoverlapF序列：5′-AGGATATCAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；EGFP1序列：5′-TTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3′。EGFPoverlapF为上游嵌合引物，从载体679位的EGFP ATG开始，下游EGFP1引物为载体的1 643位开始。50 μL PCR体系：10×buffer 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，10 μmol/L引物 1.5 μL，KOD Plus 1 μL。两次PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环。

取上2次PCR产物各1 μL作为模板并加入巢式引物，PCR反应体系同上。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环。巢式引物：A1-2 5′-TTGAAAAGTGCATCAATTTATAA-3′位于ATG上游1 007 bp位置；EGFP2 5′-TTTGGACAAACCACAACTAGAA-3′位于载体1 625 bp的位置。

1.5重叠片段测序鉴定先将扩增到的重叠片段纯化后加入A尾，加A尾为普通PCR体系：10×PCR buffer 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，10 μL普通Taq酶，1 μg PCR产物，加dH2O至50 μL。反应条件：72 ℃延伸30 min。加尾后的重叠片段和PMD18-T载体按3∶1混合，加入等体积DNA solution I，16 ℃连接5 h。将连接片段转化Top10感受态细胞，涂布氨苄LB平板，37 ℃培养过夜，挑取白色菌落。以载体通用测序引物M13-47和RV-M 进行菌落PCR扩增，1%琼脂糖电泳检测插入片段大小，将阳性克隆的菌液送出测序。

2　结果与分析

利用褐飞虱基因组为模板扩增Actin1启动子区序列，扩增出1 031 bp长片段(图1)。以pEGFP-N1载体作为模板扩增EGFP完整表达盒序列，扩增到964 bp片段 (图1)。各取2个基因PCR产物1 μL作为模板，加入巢式引物扩增得到1 953 bp片段(图1)。连接PMD18-T载体，T-A克隆测序后证实成功通过重叠延伸PCR将两基因融合(图2)。

3　讨论

对于2个基因融合的重叠延伸PCR的一般步骤：先设计4条引物A1、A2、B1、B2，其中，A2和B2为嵌合引物。A1和A2扩增A基因，B1和B2扩增B基因，将两基因片段电泳切胶回收作为模板，加入A1与A2引物扩增，在A、B基因3′端的A2、B2引物嵌合序列搭桥将A、B融合，再用A1与A2引物以融合基因作为模板进行扩增。对于三段基因融合，同样也扩增出三段基因，其中一段基因与另两段基因搭桥[8]。重叠延伸PCR需要注意：重叠延伸PCR由于是多重PCR，扩增易产生碱基错配，因此，重叠延伸PCR一般用高保真酶且控制循环数来最大限度地减低错配几率[9]。该研究以褐飞虱Actin1基因启动子区和EGFP基因融合为例，结合巢式PCR对重叠延伸PCR进行优化。只需多设计一对巢式引物，并在重叠延伸反应中用巢式引物进行扩增，这样可大大加快重叠延伸PCR过程，并增强特异性。传统重叠延伸PCR首先扩增基因后需要切胶纯化后才能进行下一步重叠，这样才能保证扩增特异性，减少杂带。且由于需纯化，对前2个基因扩增产物有一定要求才能保证回收效果，而引入巢式PCR后可省去切胶回收过程，且对前2次PCR产物要求也降低。用巢式PCR对重叠延伸PCR优化后使整个过程大大简化，同时极大提高PCR检出率，降低PCR扩增条件。

注：M.DNA Marker III；1和3.重叠延伸PCR产物；2.褐飞虱Actin 1基因启动子区扩增产物；4.EGFP 表达盒扩增产物。Note：M：DNA Marker III；Lanes 1 and 3 were SOE-PCR products；Lane 1 was amplification products of Actin 1 promoter；Lane 4 was amplification products of EGFP expression cassette图1　目的基因扩增与重叠延伸PCR扩增产物Fig.1　Amplification products of SOE-PCR and target gene amplification

注：方框为嵌合引物EGFPoverlapF序列，灰色背景序列为EGFP序列，灰色背景前序列为Actin 1启动子区序列。Note：Box was the EGFPoverlapF sequence of chimeric primer；sequence of gray background was EGFP sequence；antecedent？ sequence of gray background was the sequence of Actin 1 promoter.图2　重叠延伸PCR融合基因测序部分结果Fig.2　Sequencing results of fusion gene by SOE-PCR

[1] HO S N，HUNT H D，HORTON R M，et al.Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction[J].Gene，1989，77(1)：51-59.

[2] HORTON R M，HUNT H D，HO S N，et al.Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes：Gene splicing by overlap extension[J].Gene，1989，77(1)：61-68.

[3] 魏薇，李凡，陈海如.利用重叠延伸 PCR 技术扩增长片段 DNA[J].云南大学学报(自然科学版)，2008(S1)：86-88.

[4] 徐芳，姚泉洪，熊爱生，等.重叠延伸 PCR 技术及其在基因工程上的应用[J].分子植物育种，2006，4(5)：747-750.

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[8] THORNTON J A.Splicing by overlap extension PCR to obtain hybrid DNA products[J].Methods Mol Biol，2015，1373：43-49.

[9] 杨宇，吴元华，郑雅楠.利用重叠延伸 PCR 技术进行 DNA 的人工合成[J].安徽农业科学，2006，34(9)：1810-1811.

Optimization of Splicing by Overlap Extension PCR Using Nested PCR

PENG Lei1, ZHAO Yan2, MAYin-hua2

( 1. College of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang, Guizhou 550001; 2. College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, Hubei 430072)

[Objective] To optimize the Splicing by overlap extension PCR using nested PCR. [Method] Nested PCR was used to optimize SOE-PCR (splicing by overlap extension PCR) for combining brown planthopper (BPH)Actin1 promoter and EGFP expression cassette. [Result] Nested PCR could greatly optimize SOE-PCR. After optimization of nested PCR, the test process was simplified, and the detection time was shortened. The PCR specificity and detection rate were enhanced. [Conclusion] The optimized SOE-PCR can rapidly and effectively fuse the gene segment.

SOE-PCR; Nested PCR; Brown planthopper;Actin1 promoter

国家自然科学基金项目“水稻抗褐飞虱基因多样性持续控制褐飞虱的分子机理”(31230060)。

彭雷(1980- )，男，四川南充人，实验师，博士，从事水稻与褐飞虱互作研究。

2016-07-06

Q 78

A

0517-6611(2016)20-126-02