308 nm准分子激光照射兔耳最小红斑量

岳学苹王宏伟

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308 nm准分子激光照射兔耳最小红斑量

岳学苹1，2王宏伟1

目的： 明确308 nm准分子激光照射兔耳最小红斑量（Minimum Erythema Dose，MED）。方法： 应用308 nm准分子激光照射30只兔子左耳，分别给予单次单剂量150、300、450、600、900、1350 mJ/cm2，右侧作对照。计算30只兔耳激光照射24、48、72 h后的MED平均值，并观察96 h后组织病理和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）下超微结构的改变。结果： 经308 nm准分子激光照射后，24、48和72 h后MED平均值均为（300±55.39）mJ/cm2，其中86.6%（24只兔）MED值为300 mJ/cm2。照射96 h后MED区较未照射区的组织病理：表皮和真皮层增厚，真皮水肿、毛细血管扩张，血管周围大量炎症细胞浸润，可见红细胞外渗。TEM：MED区照射96 h后胶原纤维变性、排列紊乱，纤维细胞细胞器凝聚呈团块状变性；血管周围可见炎症细胞浸润，红细胞外渗；部分血管管腔狭窄，血管内皮细胞和周细胞细胞核形态异型。96 h后红斑逐渐消退，10～14天内消失，病理和TEM均未见大面积坏死。结论： 308 nm准分子激光是一种高效稳定和安全的光源。

308 nm准分子激光； 最小红斑剂量； 防晒

308 nm准分子激光是一种新型紫外线激光光源，为氯化氙（XeCl）准分子激光，其本质上是激光，具有激光的高方向性、单色性、高亮度和相干性。308 nm准分子激光可以在瞬间发射高强度、高能量、单一波长的308 nm紫外光（Ultraviolet B，UVB），直接照射局部皮损部位，对周围组织无明显损伤，因此可以明显缩短病程和治疗次数。临床上为了提高308 nm准分子激光治疗各种疾病的有效性，需要预估或预测最小红斑剂量（MED），以决定起始照射剂量，因此我们进行最小红斑量动物实验的体内测定方法的研究。以往研究大多以人体为研究对象，此次我们选择兔耳为对象研究308 nm准分子激光照射后MED的测量方法，期待验证该激光在动物体内实验中的稳定性、一致性、高效性和安全性，为该光源的其他应用提供基础研究。

近年来，308 nm准分子激光在皮肤科治疗白癜风、银屑病、异位性皮炎等疾病中取得了显著疗效［1-7］。应用308 nm准分子激光治疗各种皮肤疾病，如果起始照射剂量太低，会延长照射时间，太高又可能造成红斑甚至水疱，因此预估MED，选择从亚红斑剂量或1～2倍的MED开始照射，可以达到减少疗程、减少副作用、提高疗效的目的。关于308 nm准分子激光对人体，尤其是对白癜风或银屑病患者MED的测定，相关报道很多。Asawanonda等［4］应用308 nm准分子激光治疗银屑病，测得人体 MED为（203.03±57.84）mJ/cm2。Ichihashi等［8］测定的人体曝光部位 MED为 20 mJ/cm2，Waterston等［9］发现UVB照射人体不同部位皮肤后的红斑反应，结果最大可有5倍差异。那么308 nm准分子激光照射皮肤后，MED的测定方法是否稳定一致？是否具有可重复性？测定方法是否方便快捷高效？以及组织病理和TEM下发生什么改变？对皮肤是否有损伤？该方法是否安全？上述问题的相关研究不多。鉴于人体实验的伦理性和安全性很难执行，我们选择兔耳进行实验，以规避人体实验的风险，来研究308 nm准分子激光照射后MED的测量方法的稳定性、一致性，并通过病理及TEM来判断该激光照射后超微结构的改变和该方法的安全性。期待验证308 nm准分子激光作为稳定高效安全的UVB光源，进行光敏感或防晒霜的防护性能检测等方面的研究。

1 对象和方法

1.1 测试对象 测试对象为日本大耳白兔（由北京富龙腾飞实验动物研究院有限公司提供），研究区域为左侧兔耳内部无毛区域，共30只，依次编号为1～30号兔子，雌性15只，雄性15只。纳入标准：月龄、体重、耳朵大小基本一致，耳朵内部要求毛发稀疏，血管走形规律，颜色接近正常肤色。排除标准：兔耳内部毛发异常增多，血管异常充血或畸形，颜色异常充血或发红。本实验获得了首都医科大学附属北京天坛医院神经外科研究所动物伦理理论委员会的批准。1.2 测定仪器 308 nm准分子激光仪（EX-308，Excimer Laser Phototherapy System，RA Medical Systems. INC.CARLSBAS，CA，USA）；能量计测定仪（LabMax TO激光能量计，Coherent，USA）；相机（佳能500D，镜头为18～135 mm f/3.5～5.6 IS）。

1.3 测定方法 第一天，在兔子左耳内侧中央无毛区域选5 cm×3 cm区域，尽量避开血管。按照左侧纵向3个点（从上往下依次为1～3号），右侧纵向3个点（从上往下为4～6号），彼此间隔1 cm，共选6个点，每个点给予单次单剂量308 nm准分子激光照射。首先，每次照射前先用激光能量计测定该次照射的能量，多次测量能量数据结果显示能量稳定持续，1 s的照射剂量为150 mJ/cm2。选取同一耳朵6点照射区域，周围未照射区为阴性对照；因为兔耳受照面积有限，开始照射时间按50%递增，即1～6号依次为1、2、3、4、6、9 s；对应的照射剂量依次为150、300、450、600、900、1350 mJ/cm2。照射24、48、72 h后分别测定MED，MED定义为对应时间内最先出现圆形红斑所对应的最小剂量。结果判读时，由3名观察者同时判断，至少2名观察者同时认可的剂量为测试结果。最后每只兔子获得一个24 h、48 h、72 h后的MED值，然后计算30只兔子在24 h、48 h和72 h后MED的平均值。96 h后随机抽取5只兔子，对左耳未照射区和96 h后MED区取活检，行组织病理和TEM检查。活检时，先用25%乌拉坦按2 mL/kg腹腔注射给予全身麻醉，切除正常未照射部位和MED部位的兔耳全层，每个部位按1∶2分为2份，大份放入4%福尔马林固定后行组织病理学检查，小份切成1 mm×1 mm固定在4%多聚甲醛-2.5%戊二醛中，4℃冰箱固定2 h后进行TEM检查。

1.4 统计学方法 根据30只兔耳在24 h、48 h和72 h各自的MED值，计算出其MED的平均值。

2 结果

2.1 兔子的基本情况 兔子共入选30只，依次编号为1～30号兔子，雌雄各15只，均65天左右，体重分别在2 kg左右。

2.2 MED结果 MED的判读标准为对应时间内最早出现圆形红斑时对应的最小剂量。测得30只兔耳24 h、48 h和72 h的MED结果非常一致，平均为（300 ±55.39）mJ/cm2，其中86.6%（26只）为300 mJ/cm2，6.7%（2只）为150 mJ/cm2，6.7%（2只）为450 mJ/ cm2。MED区表现为圆形的充血性红斑（图1），第四天开始红斑逐渐减弱，10～14天彻底消退。

2.3 病理结果

2.3.1 组织病理 未照射区（图2a）：真表皮完整，无增厚，真皮无炎症细胞浸润，无血管扩张。MED处照射308 nm准分子激光后96 h：表皮完整，无角化不全和角化过度，表皮可见日晒伤细胞（即凋亡的角质形成细胞），表皮和真皮水肿、增厚，真皮全层有毛细血管扩张，红细胞外渗，血管周围有炎症细胞浸润（图2b）。

2.3.2 TEM 未照射区：表皮完整，真皮层未见毛细血管扩张和炎症细胞浸润，局部真皮胶原纤维（图3a）完整、横向和纵向均排列整齐；纤维细胞（图3b）形态正常，细胞核和细胞器清晰可见；毛细血管管腔无扩张，血管周围无炎症细胞浸润和红细胞外渗。MED区308 nm准分子激光照射后96 h：可见真皮层胶原纤维变性（图3c）、排列紊乱，断裂或扭曲；纤维细胞（图3d）变性，细胞器凝聚呈团块状变性；部分血管周围可见炎细胞浸润及红细胞外渗，个别血管管腔狭窄，血管内皮细胞和周细胞细胞核形态异型。

图1 308 nm准分子激光照射兔耳24 h后的MED，约300 mJ/cm2图2 2a：未照射区组织病理：表皮真皮完整，无增厚，真皮无血管扩张和炎症细胞浸润（HE，×200）；2b：MED区96 h后组织病理：表皮完整，无角化不全和角化过度，表皮可见日晒伤细胞（箭头所示），表皮和真皮增厚，真皮水肿，真皮全层有毛细血管扩张，红细胞外渗，血管周围有炎症细胞浸润（HE，×200）

图3 3a：未照射区TEM：横线和纵向的真皮胶原纤维排列整齐、结构清晰（TEM，×20000）；3b：正常兔耳TEM：真皮纤维细胞结构完整，细胞器清晰可见（TEM，×30000）；3c：MED区96 h后TEM：真皮胶原纤维变性，排列紊乱，断裂，扭曲（TEM，×20000）；3d：MED区96 h后兔耳TEM：真皮纤维细胞变性，细胞器和细胞核凝聚呈团块状（TEM，×30000）

3 讨论

本实验，我们采用308 nm准分子激光测得兔耳在24 h、48 h和72 h内的MED值均高度一致，平均值为（300±55.39）mJ/cm2。组织病理和TEM显示：与未照射区对比，照射96 h后MED区，表皮和真皮层增厚，真皮水肿、毛细血管扩张，血管周围大量炎症细胞浸润，可见红细胞外渗。TEM下可具体看到胶原纤维变性、排列紊乱，纤维细胞细胞器凝聚呈团块状变性。96 h后红斑逐渐消退，10～14天内红斑消失，病理和TEM均未见大面积坏死。

关于MED值的测定，基于Waterston等［9］发现人体不同部位照射UVB后皮肤的红斑反应，结果可以最大有5倍的差异。安全性方面，如果进行人体试验，照射后在人体多个部位取活检，不容易被人体接受，因此我们选择兔耳进行动物实验。选择兔耳，首先，兔耳内侧表皮和真皮的皮肤结构与人体结构大体类似（每层细胞厚度不同）；其次，兔耳没有毛发，不需剃毛，且颜色接近正常肤色，因此可模拟人体进行MED的测定和观察。该特殊部位肤色便于观察红斑反应和取活检。因此本实验选择兔耳作为实验对象和部位进行308 nm准分子激光照射测定MED值的测定方法的研究，在国内外暂无类似报道。尽管人的MED值因个体、部位不同而有明显差异，但针对每一个人同一部位，通过本实验，我们推测应用308 nm准分子激光照射后结果可能会稳定一致，但有待进行人体实验进一步验证。

测定MED时，因为每次照射前测量激光能量都很稳定呈直线分布，能保证给予的照射剂量稳定。我们选择24 h、48 h和72 h三个时间点观察MED结果，高度一致稳定，且86.6%的MED均为300 mJ/ cm2，足以证明308 nm准分子激光这一激光光源的稳定性和一致性。因此也证明用于治疗白癜风等疾病时，发射剂量的稳定性。

应用此激光光源照射时，激光可以瞬间在局部发出很高的能量，使达到MED的照射时间大大压缩至数秒，大大提高了实验效率。

纵观组织病理和TEM，均未见到组织坏死。临床上红斑从第四天开始红斑逐渐消退，最终10～14天彻底消退。临床和病理及TEM结果均证明308 nm准分子激光照射的安全性。因为治疗人体疾病时，产生MED的剂量，是比较好的治疗剂量，过高，会造成水疱、色素沉着等不良反应，过低，会降低治疗效果。此次，我们通过动物实验，证明了MED剂量下产生的红斑是安全的，可逆的。因此可以指导临床医师对治疗剂量的把握。

同时，308 nm准分子激光照射后，组织病理下我们发现表皮和真皮水肿、增厚，表皮可见日晒伤细胞；真皮全层毛细血管扩张，血管周围可见炎症细胞浸润。这一点与Koller等［10］和Ulrich等［11］利用紫外线（UltraViolet，UV）照射皮肤后通过反射性共聚焦显微镜（reflectance confocal microscopy，RCM）观察到的体内实验结果一致。Ulrich等［11］认为日晒伤细胞，小血管和毛细血管扩张取决于照射的UVB剂量，这一点有待于我们将来对比不同倍数的MED照射下组织病理改变以进一步验证。除此之外，Xu等［12］研究低剂量UVB（200 mJ/cm2UVB，FLl20SE灯）照射rf2基因正常和缺陷小鼠耳朵背侧，36 h后活检在rf2基因正常小鼠耳背也发现了类似的结果，而血管充血水肿等在第三天达到高峰，第四天后开始消退。我们在该实验中发现72～96 h兔耳的红斑充血反应最重，因此选择96 h后取活检。

另外，Avila Acevedo等［13］以SKH-1无毛裸鼠为研究对照，测试 6 mJ/cm2的UVB灯（302 nm，26.6 W）照射裸鼠10 min后造成急性光损伤；24 h后病理结果证明，未经保护的无毛裸鼠出现日晒伤细胞，上皮变薄，真皮血管充血，此实验与我们的实验结果类似，但我们观察到表皮充血增厚，与其结果不同。同时UVB光源、照射剂量与MED的相关性，都与我们的实验不同。为了进一步了解308 nm准分子激光照射后超微结构改变，除了组织病理，我们还进行了TEM的研究，除了发现真皮血管扩张，血管周围炎症细胞浸润，红细胞外渗；还进一步观察到有的毛细血管腔狭窄，血管内皮细胞和周细胞细胞核形态异型，关于TEM下的各种表现，未在其他相关文章中报道。

因此，通过本实验，证明了308 nm准分子激光作为新的UVB光源，具有操作迅速简单、高效准确、稳定性、可重复、安全的特点，本研究的结果，除了补充308 nm准分子激光照射人体产生的MED研究不足之外，将来主要是打算采用308 nm准分子激光作为新的UVB光源进行光敏感相关实验，或作为高效稳定的光源，进行防晒产品防护性能的测定等研究，此研究结果只是这些实验前期的基础研究。

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（收稿：2016-03-15 修回：2016-04-15）

Determination of minimum erythema dose on rabbit ear irradiated by 308 nm excimer laser

YUE Xueping1，2，WANG Hongwei2.
1.Department of Dermatology and Venereology，Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China；2.Department of Dermatology and Venereology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China
Corresponding author：WANG Hongwei，E-mail：wanghw@pumch.cn

Objective：To determine the minimum erythema dose（MED）on rabbit ear irradiated by 308 nm excimer laser.Methods：The left ears of 30 rabbits were irradiated with the 308 nm eximer laser and the right ears were taken as the negative controls.The irradiation doses of the eximer laser on the left ears were 150，300，450，600，900 and 1350 mJ/cm2.Then the average MED after 24 h，48 h and 72 h in 30 rabbitswas calculated，and the micro-structure was observed under transmission electron microscopy（TEM），at 96 h after irradiation.Results：The average MED after 24 h，48 h and 72 h was 300±55.39 mJ/cm2.Compared with non-irradiated areas，the MED area after 96 h irradiation showed that the epidermis and dermis were thick，edema，and angiotelectasis.The blood vessels were infiltrated with lots of inflammatory cells.Under TEM，in the MED area irradiated after 96 h，there were degeneration and disorganization of collagen fibres，and fibrocyte organelle was coalesced presenting as crumby degeneration.Around blood vessels there was infiltration with inflammatory cells and erythrocyte exosmosis.Erythema gradually regressed in 96 h and disappeared in 10-14 days，without any large area of necrosis in pathology and TEM.Conclusion：308 nm eximer laser is highly stability and safety.

308 nm excimer laser；MED；sunscreen

1中国医学科学院北京协和医院皮肤性病科，北京，100050

2首都医科大学附属北京天坛医院皮肤性病科，北京，100730

王宏伟，E-mail：wanghw@pumch.cn