粤西地区凡纳滨对虾虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒感染情况的初步调查

陈禄芝，余霞艳，胡一丞，李色东

(1.湛江恒兴南方海洋科技有限公司，广东 湛江，524073；2.湛江市海洋与渔业发展研究中心，广东 湛江，524039；3.南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东 广州，510275)



粤西地区凡纳滨对虾虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒感染情况的初步调查

陈禄芝1，3，余霞艳1，3，胡一丞1，3，李色东1，2，3*

(1.湛江恒兴南方海洋科技有限公司，广东 湛江，524073；2.湛江市海洋与渔业发展研究中心，广东 湛江，524039；3.南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东 广州，510275)

针对近年来粤西地区养殖户普遍反映凡纳滨对虾长不大的情况，本实验室运用对虾EHP和IHHNV的荧光定量PCR检测方法，对该两种病原进行了流行性调查。结果显示，在87份样品中，EHP的检出率为41.38%，IHHNV的检出率为12.18%。在检测样品中，两份不同海域的海水样品有检测到EHP和IHNNV，而经处理过的养殖用水和育苗用水中未检测出上述病原；成虾的EHP检出率最高达93.75%，种虾的IHHNV检出率最高为38.10%。在本地选育的种虾和进口种虾中，均有检出EHP，检出率分别为80.00%和33.33%，进口种虾中未检测出IHHNV。在不同养殖场样品的检测结果中，EHP载量指数最高的对虾平均日增长体重最小，即载量指数为10的对虾样品日增长量为0.039g；而EHP载量指数最低的日增量大，即载量指数为2的日增长量为0.90g。对B养殖场不同养殖时长的对虾进行检测，结果发现3份样品的EHP载量指数分别为6、7和7；B养殖场20号池不同规格的对虾EHP载量指数均为4。

凡纳滨对虾；虾肝肠胞虫(EHP)；传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV)；实时荧光定量PCR

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)原产于太平洋西海岸至墨西哥湾中部，具有生长快、抗逆性强、易养殖等特点，是当前世界对虾养殖产量最高的优良品种之一。自2001年以来，凡纳滨对虾养殖面积和产量占据我国对虾养殖面积和产量的首位。目前凡纳滨对虾在养殖过程中遇到大小不均、长不大等问题，给养殖户造成了很大的损失。有研究认为，引发这些问题的病原可能是虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒[1]。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP或者ECZ)，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，2009年在泰国的斑节对虾中被首次发现而命名，另有研究表明EHP病原体来自于澳大利亚，而且虾与虾之间的直接传播方式可能来自于鲜活饵料[2-3]。在国内，中国水产科学研究院黄海水产研究所对该寄生虫研究较多，称之为肠胞虫，并且建立了一套快速检测肠胞虫的方法[4]。感染EHP的对虾肌肉发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩[5]，俗称“棉花虾”[4]。虽然这不会导致对虾的死亡，但虾肝肠胞虫却是近年来凡纳滨对虾生长缓慢的主要原因之一[6-7]。除虾肝肠胞虫外，传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectionshypodermalandhematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)也是导致养殖对虾生长缓慢的主要原因之一，感染IHHNV的凡纳滨对虾生长迟缓，甚至整个养殖期都无法长大[8]。EHP和IHHNV传播途径较广，既可通过受精卵或种苗垂直传播[9]，也可以通过养殖水体水平传播[10]。这两种病害目前已严重影响对虾养殖业的健康与持续发展。

针对养殖户反映的凡纳滨对虾生长缓慢的现象，本研究采用EHP和IHHNV实时荧光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)检测方法，对粤西地区的凡纳滨对虾亲虾、虾苗、成虾、饵料、鲜活饵料和育苗与养殖水体进行检测，分析这两种病原在种苗生产与对虾养殖中的流行情况。

1　材料与方法

1.1实验材料

采用探针法荧光定量PCR，对EHP和IHHNV进行检测；EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒、IHHNV实时荧光定量PCR检测试剂盒均来自国家海洋局第三海洋研究所(厦门)；荧光定量PCR仪(TL988)；解剖剪等。

1.2实验方法

1.2.1样品预处理

虾苗：用生理盐水冲洗虾苗表面3次以上，随机挑取0.1g，置于玻璃研磨器中充分研磨后，转入1.5mL的EP管中，提取DNA。亲虾、成虾：分别取鲜活虾体的肝胰脏0.1g，处理方式同上。种虾饵料：取种虾饵料0.1g，处理方式同上。水样：各取80mL的水样分装于50mL离心管，6 000rpm离心8min，弃上层清夜，留少许上清液，悬浮沉淀，转入1.5mL的EP管中，12 000rpm离心5min，弃上层清夜。

1.2.2样品DNA提取

预处理的样品参照试剂盒说明书提取样品总DNA。

1.2.3Real-timePCR检测

以上述提取的DNA为模板，进行real-timePCR检测。20uL反应体系，参照试剂盒的说明书进行配制。扩增条件：95℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s(此处采集荧光，设置为FAM绿色荧光)，共40个循环。

1.2.4试剂盒特异性检测

EHP试剂盒特异性检测：分别选择传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)的质粒标准品和健康的凡纳滨对虾总DNA为阴性对照，水为模板的空白对照，以感染EHP的凡纳滨对虾总DNA为阳性，通过real-timePCR扩增检测，分析试剂盒特异性。

IHHNV试剂盒特异性检测：分别选择虾肝肠胞虫(EHP)、白斑综合征病毒(WSSV)的质粒标准品和健康凡纳滨对虾总DNA为阴性对照，水为模板的空白对照，以感染IHHNV的凡纳滨对虾总DNA为阳性，通过real-timePCR扩增检测，分析试剂盒特异性。

1.2.5Real-timePCR标准曲线以及重复性试验

分别对EHP、IHHNV检测试剂盒的4个阳性标准品(4个梯度)进行real-timePCR，建立质粒拷贝数与循环数(Cycleofthreshold，Ct)对应的标准曲线，通过分析标准曲线相关系数来判断标准曲线的质量，重复3次。用Excel对重复性扩增结果的Ct值进行方差分析。

1.2.6数据处理方法

本文采用生物统计学方法对样品进行取样处理，运用Excel对检测结果进行数据统计和分析。

相比启发式算法存在精度不高的问题，采用线性数学优化方法可以寻找到全局最优解或近优解，以Marco等[9]为代表，将FPGA布局问题转化为MILP求优问题，文献[10]中首先对芯片资源和待布局逻辑功能进行建模，然后设立芯片和逻辑功能需要满足的各项约束，最后确定优化目标函数.采用该方法可以有效提高布局精度，但是由于求解时间过长，通常在待布局逻辑功能数量过大时需要设置求解器的运行时限，同时，随着FPGA芯片规模不断扩大，对其进行准确建模的难度也急剧增加.

2　结果与分析

2.1试剂盒特异性检测

EHP试剂盒特异性检测结果如图1所示。结果显示，除了感染EHP的凡纳滨对虾样品有扩增曲线外，其余样品均未检测到荧光信号。

IHHNV试剂盒特异性检测结果如图2所示。结果显示，除了感染IHHNV的凡纳滨对虾样品有扩增曲线外，其余样品均未检测到荧光信号。

2.2Real-timePCR标准曲线以及重复性实验

分别对EHP、IHHNV检测试剂盒的4个阳性标准品(4个梯度)进行real-timePCR，以蒸馏水为空白对照，其扩增曲线呈标准的S曲线(图3和图4)。

对EHP、IHHNV检测试剂盒进行重复性实验分析，结果如表1和表2所示。从表中可知，组内3个平行Ct值基本一致，方差小于1，且变异系数小于15%，结果表明试剂盒重复性满足检测要求。

表1　EHP实时荧光定量PCR检测重复性试验

表2　IHHNV实时荧光定量PCR检测重复性实验

2.3多种样品的EHP和IHHNV检测结果

用real-timePCR检测方法对粤西地区的有关凡纳滨对虾样品进行EHP和IHHNV检测，结果汇总后如表3所示。从表中可知，共检测的87份样品中，EHP的检出率为41.38%，IHHNV的检出率为12.18%。成虾和种虾样品的EHP检出率较高，分别为93.75%和66.67%。同样，IHHNV检出率也较高，分别为31.25%和38.10%。其中未经处理过的2份海水样品均有检出EHP和IHNNV，但经过砂滤、臭氧消毒、泡沫分离、紫外消毒等一系列处理后的育苗与养殖用水未检测到EHP和IHHNV。

表3　粤西地区凡纳滨对虾有关样品EHP和IHHNV的检测结果

2.4进口样品与本地样品的EHP和IHHNV检测结果

分别对进口种虾、进口一代苗、本地种虾和本地虾苗进行检测，结果见表4。从表中可知，6份进口种虾样品中，EHP检出率较低，为33.33%，且未检测到IHHNV。同样，进口的一代苗中，EHP检出率为30.00%，IHHNV的检出率较低，为10%。本地种虾的EHP和IHHNV检出率最高，分别为80.00%和53.33%。本地虾苗的EHP检出率为21.74%，IHHNV检出率为34.78%。

表4　进口种虾与本地种虾的EHP和IHHNV检测结果

2.5不同成虾样品的EHP和IHHNV检测结果

为探究凡纳滨对虾感染EHP和IHHNV对生长的影响，对不同养殖环境(不同养殖场)、不同养殖时长和不同规格的对虾样品进行了上述病原的检测。不同养殖场成虾检测结果如表5所示，A养殖场的肠胞虫载量最高，对虾平均日增长体重(以下简称“日增长量”)最低，为0.039g。C养殖场的肠胞虫含量最少，其平均日增长量比其它两个场的高，为0.090g。3个养殖场的样品均未检测出IHHNV。

表5　不同养殖场成虾样品的检测结果

注：表中“-”代表检测结果呈阴性，下同。

Notes：-representedanegativetestresultsinthetable，thesamebelow.

B养殖场不同养殖时长对虾的检测结果如表6所示。3份样品均有检出EHP，其日增长量最大的B-24样品，EHP载量相对最低；而日增长量最小的B-17样，EHP载量相对较高。另在B-23的样品中有检出IHHNV。

表6　B养殖场不同养殖时长成虾的EHP和IHHNV病原检测结果

B养殖场20号池不同规格对虾(养殖时间116d)的检测结果如表7所示，EHP的载量指数(ERCEHP)相同；其平均日增长量为0.071g，其成虾样品中没有检测到IHHNV。

表7　B养殖场20号池不同规格虾的EHP和IHHNV检测结果

根据以上检测对虾的养殖时长和体重以及对其EHP的检测结果，得到日增长量与EHP载量指数(ERCEHP)的关系图(图5)。从图中可见对虾的日增长量与EHP载量指数呈一定的对数关系(R2=0.574 3)。

3　讨论

近年来，EHP在全球凡纳滨对虾养殖业中流行范围很广，先后在泰国、马来西亚、印度等国检测出该病原，在我国江苏沿海和广东沿海地区也都有检出。EHP严重威胁着对虾养殖业的发展，给养殖户带来了巨大的经济损失。2015年浙江省水产技术推广站对浙江地区的134份虾苗样品进行检测，EHP的检出率高达53.8%[11]，HHNV的检出率为25.4%[11]；江苏沿海地区凡纳滨对虾EHP的发病率约为25.0%[12]。本研究对粤西区域的87份样品进行检测，EHP的检出率为41.38%，IHHNV的检出率为12.18%。另在检测样品中，发现未经过处理的海水样品均有检测到EHP和IHNNV，而经过砂滤、臭氧消毒、精密过滤、紫外消毒等一系列处理过的水体中未检测出上述病原，可见消毒处理可以预防感染EHP和IHHNV。

微孢子虫广泛的宿主范围使得国内外研究者对其识别和检测进行了大量探索研究。传统的染色镜检法直观，但对检测人员的技术要求高，而方法灵敏度低；免疫学检测技术主要利用抗体与抗原特异性结合的原理，结合免疫放大技术，其操作简便，但特异性和灵敏度有待进一步提高。本实验使用绝对定量PCR方法，不同于一般相对定量法利用内参基因得到相对表达量，绝对定量法通过测定已知拷贝数的质粒标准品，得到Ct值与拷贝数的标准曲线，然后测定样品的Ct值，代入标准曲线得出具体的样品中病毒的拷贝数，具有灵敏度和特异性高的特点，操作简便，省时省力，适用于大批量样品的检测。

从本文对不同养殖场、不同养殖时长和不同规格对虾的检测结果中发现：3个养殖场的对虾EHP载量差异大，EHP载量高的对虾日增长量最小，而日增量大的EHP载量低；在B养殖场不同时长的对虾检测结果中，发现养殖时长与EHP载量没有相关性，其感染量基本相同；B养殖场20号池不同规格的对虾EHP载量指数一致。综上所述，对虾EHP的载量与养殖环境有紧密联系，环境不同其EHP的载量指数不同。因此在对虾养殖过程中，养殖水体、饲养饵料以及养殖工具等环境因素的严格把关，对控制对虾感染EHP病原极为重要。对虾日增长量与EHP载量指数呈一定的对数关系(R2=0.574 3)，EHP载量指数增大，日增长量呈对数下降。结果与刘珍[4]的实验结果呈负相关性吻合。但由于实验局限，R2较低，且样品的养殖环境和感染时间有差异，因此EHP载量指数与对虾日增长的关系有待后期实验进一步的探索，本文结果可作为一个探讨趋势。

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Preliminary investigation of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)from Litopenaeus vannamei in west Guangdong Province

CHEN Luzhi1,3，YU Xiayan1,3，HU Yicheng1,3，LI Sedong1,2,3*

(1.ZhangjiangEvergreenSouthOceanTechnologyCo.Ltd.,Zhanjiang524073,China;2.ZhanjiangOceanandFisheryDevelopmentResearchCenter,Zhanjiang524039,China;3.TheBiologicalResourcesDevelopmentandUtilizationofCollaborativeInnovationCenteroftheSouthChinaSea,Guangzhou510275,China)

Inrecentyears,thegrowthretardationofwhiteshrimp(Litopenaeus vannamei)hasbeenacommonphenomenoninwestGuangdongProvince.ThepotentialpathogeniesofthisdiseaseareconsideredEnterocytozoon hepatopenaei (EHP)andinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV).Thefluorescentquantitativereal-timePCR(RT-PCR)methodswerefoundedsoastoestimatetheepidemicofthesetwopathogenies.Thesemethodswereusedtodetect87samplesofjuniorshrimps,parentshrimps,adultshrimps,freshfeedandwaterwhichsampledacrossthewestGuangdongProvince.TheresultsshowedthatthepositiverateofEHPwas41.38%,theIHHNVpositiverateof12.18%.Andintestingsamples,EHPandIHNNVhavebeendetectedintwoseawatersamplesindifferentareas,buthavenotbeendetectedincultivationwateraftersterilized.ThehighestEHPpositiverateofadultshrimpswas93.75%andhighestIHHNVpositiverateof38.10%.EHPwasdetectedinbothlocalandimportedparentshrimp,positiverateof80.00%and33.33%,respectively,butIHHNVwasnotdetectedinimportedparentshrimp.Inthetestresultsofsampleswithdifferentfarms,theshrimp,whichloadindexofEHPwasthehighestof10,theaverageweightofdailygrowthwastheminimumof0.039g.AndloadindexofEHPwasthelowestof2,whiletheaverageweightofdailygrowthwasthemaximumof0.090g.ButtheloadindexofEHPwasthesamewiththedifferentsizeshrimpsinthepoolof20.ThenitwasfoundthatthecontentofEHPinsmallerjuniorshrimpsfromdifferentpondswassignificantlyhigherthanlargeones,indicatingthatEHPhadasignificantimpactonthegrowthoftheshrimp.TheyhadasimilarogarithmicrelationshipandthecorrelationcoefficientwasR2= 0.574 6.

Litopenaeus vannamei;EHP;IHHNV;real-timePCR

2016-06-17

国家虾产业技术体系(CARS-47)；饵料微藻的浓缩产品开发及应用示范(A201508C05).

陈禄芝(1990-)，女，硕士，研究方向：水产经济动物病害防治.E-mail：clz4900@163.com

李色东(1963-)，男，教授级高级工程师，研究方向：水产经济动物育种.E-mail：lisedong@163.com

S-3

A

1006-5601(2016)04-0273-08

陈禄芝，余霞艳，胡一丞，等.粤西地区凡纳滨对虾虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒感染情况的初步调查[J].渔业研究，2016，38(4)：273-280.