切除修复交叉互补基因1、核糖核苷酸还原酶M 1亚基和3型β微管蛋白分子检测指导晚期非小细胞肺癌个体化治疗的临床效果

尹志永　杨大勇　杨立丰　李　华　王铁军　陈丽娜.河北省秦皇岛市第二医院胸外科，河北秦皇岛　066600；.河北省秦皇岛市第二医院神经外科，河北秦皇岛066600；.河北省秦皇岛市第二医院检验科，河北秦皇岛　066600

切除修复交叉互补基因1、核糖核苷酸还原酶M 1亚基和3型β微管蛋白分子检测指导晚期非小细胞肺癌个体化治疗的临床效果

尹志永1杨大勇1杨立丰2李华3王铁军3陈丽娜1
1.河北省秦皇岛市第二医院胸外科，河北秦皇岛066600；2.河北省秦皇岛市第二医院神经外科，河北秦皇岛066600；3.河北省秦皇岛市第二医院检验科，河北秦皇岛066600

目的 探讨切除修复交叉互补基因1（ERCC1）、核糖核苷酸还原酶M1亚基 （RRM1）和3型β微管蛋白（TUBB3）分子检测在指导晚期非小细胞肺癌（NSCLC）个体化治疗的临床效果。方法 将2013年1～11月秦皇岛市第二医院胸外科住院治疗的48例经病理确诊的晚期NSCLC患者分为实验组（20例）和对照组（28例）。实验组采用SYBR荧光实时定量PCR检测方法检测患者胸水或静脉血中ERCC1、RRM1和TUBB3的表达量，根据表达情况选择化疗方案；对照组则均采用顺铂与吉西他滨联合治疗。经过2个周期治疗后比较两组的疗效、不良反应及疾病进展、生存获益情况。结果 实验组的总有效率和总控制率均显著高于对照组（P＜0.05）；实验组和对照组治疗后的PS评分均显著高于治疗前（P＜0.05），但两组治疗后的PS评分、PS评分改善率差异均无统计学意义（P＞0.05）；两组间不良反应发生率差异无统计学意义（P＞0.05），且两组间不同系统的不良反应严重程度差异均无统计学意义 （P＞0.05）。 结论 实时定量PCR技术检测病理组织的ERCC1、RRM1和TUBB3表达水平用于指导晚期NSCLC患者个体化治疗，可提高治疗有效率和疾病控制率，但在改善生活质量和减少不良反应发生效果不显著，建议进一步探索标志物指导下更为有效的化疗方案。

切除修复交叉互补基因1；核糖核苷酸还原酶M 1亚基；3型β微管蛋白；非小细胞肺癌；化疗

肺癌是最常见的肿瘤之一，目前已成为造成患者死亡的首位癌症。其中NSCLC最为常见，占所有肺癌的80%以上。随着目前临床的不断研究，化疗为NSCLC的首选治疗方法，且顺铂、吉西他滨等化疗药物对NSCLC的疗效显著［1-2］。但是随着疗程的持续治疗，耐药现象逐渐突出，药物效果逐渐下降。本研究通过对比分析以胸水或静脉血中切除修复交叉互补基因1（ERCC1）、核糖核苷酸还原酶M1亚基（RRM1）和3型β微管蛋白（TUBB3）表达量选择化疗方案与直接进行顺铂、吉西他滨联合治疗两种化疗方法的临床效果和不良反应发生情况，探讨ERCC1、RRM1与TUBB3检测在指导晚期NSCLC个体化治疗的临床意义，现报道如下：

1　资料与方法

1.1一般资料

随机选取2013年1～11月秦皇岛市第二医院胸外科住院治疗的晚期NSCLC患者48例，其中男26例，女22例，平均年龄（55.17±12.47）岁；其中鳞状细胞癌23例、腺癌25例。患者分为实验组和对照组，其中实验组20例，男 12例，女 8例，平均年龄（54.50± 10.79）岁，鳞状细胞癌8例、腺癌12例，肿瘤分期Ⅲ期b8例、Ⅳ期12例；对照组28例，男14例，女14例，平均年龄（55.57±11.24）岁，鳞状细胞癌15例、腺癌13例，肿瘤分期Ⅲb期11例、Ⅳ期17例。两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者和/或家属均知情同意并签署知情同意书。

纳入标准［3］：①临床症状符合NSCLC诊断标准；②经CT检查证实存在肿瘤病灶，均经气管镜活检或穿刺或胸水病理确诊；③肿瘤分期属于Ⅲb和Ⅳ期；④初诊且未经过治疗；⑤体力状况评分（ECOG PS评分）小于3分（5分法），且生存期大于3个月。

排除标准［3］：①患有感染性疾病、肝肾疾病、慢性心脏病等疾病；②合并其他系统疾病。

1.2ERCC1、RRM 1和TUBB3基因表达检测

肿瘤相关基因mRNA表达水平实时荧光定量PCR检测试剂盒为南京生兴生物公司生产。血液（液体样本）总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）、cDNA合成试剂盒、pGM-T载体试剂盒均为Bioteke公司产品。在实验组患者入组后（未开展化疗）进行穿刺获得胸水（40 mL）或抽取静脉血（10 mL）做为样本，按照试剂盒操作步骤首先进行总RNA提取，通过琼脂凝胶电泳检测其纯度，并使用分光光度仪测得D260nm/ D280nm在1.7～2.1。然后按照cDNA合成试剂盒操作步骤进行cDNA合成，将所得cDNA经PCR扩增后得到目的DNA。选用pGM-T载体试剂盒进行TA克隆，所得质粒进行PCR鉴定，并测序鉴定所得产物序列的正确性。选用肿瘤相关基因mRNA表达水平实时荧光定量PCR检测试剂盒，按操作步骤进行，将质粒标准品及管家基因质粒标准品等比稀释成6个浓度后进行SYBR荧光实时定量PCR检测，反应条件：聚合酶的活化时间20 s；双链DNA在95℃变性，再迅速冷却至60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至72℃，使引物链沿模板延伸；PCR扩增循环次数40个循环。检测出质粒样本中ERCC1、RRM1和TUBB3基因的mRNA表达量，按照表达量的多少分为无表达、低表达和高表达。

1.3个体化化疗方案

实验组患者根据ERCC1、RRM1和TUBB3基因表达量确定化疗方案：ERCC1基因低表达或无表达者采取以铂类为主的两种药物治疗，RRM1基因低表达或无表达者采取吉西他滨单药治疗或以吉西他滨为主的两种药物治疗，TUBB3基因高表达者需避免使用紫杉类化疗药物。实验组共计出现以下4类情况：ERCC1和RRM1低表达或无表达，而TUBB3基因高表达者5例，采取顺铂与吉西他滨共同治疗；ERCC1、RRM1和TUBB3基因均呈现低表达或无表达8例，采取顺铂与吉西他滨共同治疗；ERCC1和TUBB3基因高表达，而RRM1低表达或无表达3例，采取吉西他滨单独治疗；ERCC1和RRM1高表达，而TUBB3基因低表达者4例，采取多西他赛单独治疗。对照组患者均采取顺铂与吉西他滨共同治疗。用药剂量根据体表面积给予常规治疗，严重者可适当加量。用药期间患者若出现恶心、呕吐、白细胞降低、出血、转氨酶升高等不良反应，其严重程度具体参照WHO化学药物毒副作用评定标准［4］评定等级，轻度：Ⅰ级+Ⅱ级，重度：Ⅲ级+Ⅳ级。可适当给予止吐、升白、补充血小板、保肝等对症治疗以缓解不良反应。

1.4疗效判断

在患者化疗2个周期后进行疗效判断，判断标准为RECISE1.0。判定结局包括部分缓解（PR）、完全缓解（CR）、稳定（SD）和进展（PD），部分缓解和完全缓解合计为有效，部分缓解、完全缓解和稳定合计为疾病控制，计算总有效率和疾病控制率 ［总有效率=（PR+ CR）/总例数×100%、疾病控制率=（PR+CR+SD）/总例数×100%］。分别在治疗前后对患者进行PS评分［5］，以治疗前后评分差值（治疗后-治疗前）判定化疗对患者生活质量的改善效果：①部分改善：差值=1；②完全改善：差值≥2；③稳定：差值=0；④下降：差值≤1。总改善率=（部分改善+完全改善）/总例数×100%。同时分析两组治疗期间各系统不良反应发生率及其严重程度。

1.5统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料用中位数（M）及四分位数间距（Q）或四分位数（P25，P75）表示，采用秩和检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组疗效比较

化疗2个周期后，实验组20例患者中PR、CR、SD和PD分别为13例（65.00%）、0例（0.00%）、4例（20.00%）和3例（15.00%），对照组28例患者中PR、CR、SD和PD分别为9例（32.14%）、1例（3.57%）、6例（21.43%）和12例（42.86%），两组总有效率分别为65.00%和35.71%，疾病控制率分别为85.00%和57.14%，实验组的总有效率和总控制率均显著高于对照组（χ2=4.009、4.214，P=0.045、0.040）。

2.2两组治疗前后PS评分比较

实验组和对照组治疗后的PS评分均显著高于治疗前（t=2.302、2.216，P＜0.05），但两组间治疗前及治疗后的PS评分差异均无统计学意义（χ2=0.061、0.202，P=0.806、0.655）。实验组和对照组的PS评分改善率分别为60.00%和57.14%，两组间PS评分改善率差异无统计学意义（χ2=0.042，P=0.841）。见表1。

表1　两组治疗前后PS评分比较

2.3两组治疗期间不良反应发生情况比较

实验组治疗期间有17例（85.00%）患者发生不良反应，其中涉及消化系统7例（35.00%）、血液系统8例（40.00%）、其他2例（10.00%）；对照组治疗期间有27例（96.42%）患者发生不良反应，其中单独涉及消化系统6例（21.43%）、血液系统13例（46.43%）、其他2例（7.14%）、同时涉及消化系统和血液系统4例（14.29%）、同时涉及血液系统和其他系统2例（7.14%）。两组间不良反应发生率差异无统计学意义 （χ2=0.779，P= 0.377），且两组间消化系统、血液系统和其他系统的不良反应严重程度差异也均无统计学意义（χ2=0.000，P=1.000）。见表2。

表2　两组治疗期间不良反应发生情况比较［n（%）］

3　讨论

近年来肺癌的发病率一直趋于攀升状态，已经成为目前造成人群死亡的最主要疾病之一。早期放射治疗、化学治疗和手术治疗为肿瘤治疗的主要方法，其中化学治疗应用最为广泛。随着第三代化疗药物吉西他滨的开发应用，吉西他滨联合顺铂的化疗方案得到临床认可和广泛应用［6-7］。但是随着临床NSCLC患者的化疗观察，发现吉西他滨联合顺铂化疗方案虽可显著改善患者的生活质量和提高生存时间，但是个体间疗效差异大，一些患者在治疗无效的情况下还要经历药物的毒副作用，患者总生存率在40%以下［8-9］。为了更好地诊治NSCLC患者，提高化疗的有效率和生存率，临床上开发出一种新的化疗思路，即个体化化疗。此化疗思路及考虑癌症患者药物基因组学和药物遗传学特点，选择最佳且特异的化疗药物方案进行化疗。个体化化疗方案已在临床上得到广泛认可和应用，经临床观察，该方法可显著提高化疗的针对性，提高治疗有效率的同时还可最大程度的延长生存时间［10］。

研究发现ERCC1、RRM1与TUBB3基因的表达与晚期NSCLC化疗疗效密切相关，可用于指导晚期NSCLC化学治疗。ERCC1是人体内众多DNA损伤修复基因中的一种，同时还是核苷酸切除修复通路中起关键作用的一种酶，ERCC1的表达与铂类-DNA加合物的消除过程中起着重要的作用。研究发现：ERCC1高表达可导致SNP，继而引起铂类药物耐药以及加速铂类药物所引起的DNA加合物消除，降低铂类药物疗效［11］。RRMl位于染色体中的llpl5.5片段，NSCLC患者该区域常可出现杂合子缺失。研究发现：RRM1与肺癌患者吉西他滨耐药密切相关，RRM1是人体内核糖核酸还原酶的重要组成部分，参与脱氧核苷酸的生产，是人体内DNA修复和合成的限速酶，RRM1mRNA高表达者常可表现为对吉西他滨耐药，该患者接受顺铂或者抗微管药物（紫杉烷类、长春瑞滨等）治疗效果较好［12］。随着抗微管药物在临床的不断使用，研究显示该类药物耐药与体内 TUBB3表达密切相关，TUBB3高表达患者在使用抗微管类药物时疗效较其他化疗药物差［13-14］。

本研究利用ERCC1、RRM1与TUBB3基因表达情况选择患者个体化化疗方案为实验组，采用顺铂与吉西他滨联合统一治疗为对照组，对比分析发现：实验组的总有效率（65.00%）和总控制率（85.00%）均显著高于对照组（35.71%、57.14%）（P＜0.05），提示个体化化疗可提高化疗有效率。在改善生活质量上，两组治疗后的PS评分均显著高于治疗前（P＜0.05），而两组间治疗前及治疗后的PS评分、PS评分改善率差异均无统计学意义（P＞0.05），提示两种治疗方法均可改善患者生活质量，但两种治疗方法在改善生活质量上无差异；两组不良反应总发生率差异无统计学意义（P＞0.05），而且两组间消化系统、血液系统及其他系统的不良反应的严重程度差异也无统计学意义 （P＞0.05），提示个体化化疗方案在改善不良反应的发生上作用不明显。

综上所述，实时定量PCR技术检测胸水或静脉血中ERCC1、RRM1和TUBB3表达水平用于指导晚期NSCLC患者个体化治疗，可提高治疗有效率和疾病控制率，但在改善生活质量和降低不良反应发生效果不显著，建议进一步探索标志物指导下更为有效的化疗方案。

［1］Backhus LM，Wood DE.Management of centrally located non-small-cell carcinoma［J］.Oncology，2014，28（3）：215-221.

［2］Cagle PT，Sholl LM，Lindeman NI，et al.Template for re porting results of biomarker testing of specimens from patients with non-small cell carcinoma of the lung［J］. Archives of Pathology&Laboratory Medicine，2013，138 （2）：171-174.

［3］Xu J，Yue CF，Zhou WH，et al.Aurora-a contributes to cisplatin resistance and lymphatic metastasis in non-small cell lung cancer and predicts poor prognosis［J］.Journal of Translational Medicine，2014，12（1）：1158-1168.

［4］戈伟，伍钢.实用肺部肿瘤学［M］.北京：人民军医出版社，2003：346-347.

［5］Tanabe S，Myojin M，Shimizu S，et al.Dose-volume analysis for respiratory toxicity in intrathoracic esophageal cancer patients treated with definitive chemoradiotherapy using extended fields［J］.Journal of Radiation Research，2013，54（6）：1085-1094.

［6］Maha H，Stephanie D，Neeraj A，et al.A randomized phase 2 trial of gemcitabine/cisplatin with or without cetuximab in patients with advanced urothelial carcinoma［J］.Cancer，2014，120（17）：2684-2693.

［7］Bamias A，DafniU，Karadimou A，et al.Prospective，openlabel，randomized，phaseⅢstudy of two dose-dense regimens MVAC versus gemcitabine/cisplatin in patients with inoperable，metastaticor relapsedurothelial cancer：a Hellenic Cooperative Oncology Group study（HE 16/03）［J］. Annals of Oncology Official Journal of European Society for Medical Oncology，2013，24（4）：1011-1017.

［8］Lv C，Ma Y，Feng Q，et al.A pilot study：sequential gemcitabine/cisplatin and icotinib as induction therapy for stageⅡB toⅢA non-small-cell lung adenocarcinoma［J］. World Journal of Surgical Oncology，2013，11（8）：187-194.

［9］Birtle A.Heir to the throne or young pretender：can targeted therapy added to gemcitabine-cisplatin doublet therapy improve outcomes for advanced urothelial cancer？［J］. European Urology，2015，67（4）：603-604.

［10］Li CH，Liu MY，Liu W，et al.Randomized control study of nedaplatinorcisplatinconcomitant withother chemotherapy in the treatment of advanced non-small cell lung cancer［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2014，15（2）：731-736.

［11］Xie KJ，He HE，Sun AJ，et al.Expression of ERCC1，MSH2 and PARP1 in non-small cell lung cancer and prognostic value in patients treated with platinum-based chemotherapy［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2014，15（6）：2591-2596.

［12］Jiang B，Tu C，He W，et al.Analysis of RRM1 Expression and efficacy of gemcitabine in advanced non-small cell lung cancer［J］.Cancer Research on Prevention& Treatment，2013，40（1）：68-71.

［13］Yu D，Li J，Han Y，et al.Gene expression profiles of ERCC1，TYMS，RRM1，TUBB3 and EGFR in tumor tissue from non-small cell lung cancer patients［J］.Chin Med J，2014，127（8）：1464-1468.

［14］Qiao H，Huang X，Guo H，et al.ERCC1，RRM1 and TUBB3 mRNA expression on the tumor response and overall survival of non-small cell lung cancer treated with platinum-based chemotherapy［J］.Pakistan Journal of Medical Sciences，2014，30（6）：1403-1408.

Clinical effect of ERCC1，RRM 1 and TUBB3 detection guiding individual chemotherapy for patients with advanced non-small-cell carcinoma

YIZhiyong1YANG Dayong1YANG Lifeng2LIHua3WANG Tiejun3CHEN Li'na1
1.Department of Thoracic Surgery，the Second Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao066600，China；2.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao 066600，China；3.Department of Laboratory，the Second Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao 066600，China

Objective To explore the clinical effect of excision repair cross complementary1（ERCC1），ribonucleofide reductase large subunit 1（RRM1）and tubulinβ3（TUBB3）molecular detection guiding advanced non-small-cell carcinoma（NSCLC）individualized treatment.Methods From January to November 2013，in the Second Hospital of Qinhuangdao City，48 patients with pathologically diagnosed advanced NSCLC were selected and divided into experiment group（20 cases）and control group（28 cases）.The experiment group were given SYBR real-time PCR testingmethods to detect expression levels of ERCC1，RRM1 and TUBB3 with pleural fluid or blood，according to the expression results，the chemotherapy schemewas chosen；the control group were given combination therapy with Cisplatin and Gemcitabine.The efficacy，toxicity and disease progression，survival benefit situation after two treatment cycles of two groups were compared.Results The total efficiency and total control rate in the experiment group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）；PS scores after treatment in experiment group and control group were significantly higher than those before treatment（P＜0.05），the PS scores，PS score improvement rate in two groups after treatmentwere compared，the difference was not statistically significant（P＞0.05）；the incidence of adverse reactions in two groups was compared，the difference was not statistically significant（P＞0.05），and the severityof adverse reactions of different systems in two groups were compared，the differences were not statistically significant （P＞0.05）.Conclusion Real-time quantitative PCR to detect the expression levels of ERCC1，RRM1 and TUBB3 in pathology organization to guide individualized treating patients with advanced NSCLC can improve treatment efficiency and disease control rate，but it is not significant in improving the quality of life and reduce the occurrence of adverse，further to exploremore effective chemotherapy regimen under the guidance of themarkers is recommended.

Excision repair cross complementary1；Ribonucleofide reductase large subunit 1；Tubulinβ3；Nonsmall-cell carcinoma；Chemotherapy

R734.2

A

1673-7210（2016）01（b）-0081-04

2015-09-15本文编辑：苏畅）

河北省秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（2012023A073）。

尹志永（1979.10-），男，副主任医师；研究方向：肺癌的个体化治疗。