中高危MDS与MDS/MPN患者骨髓单个核细胞凋亡及临床特征比较

刘小柳　邹立新　雷　坚　张曙辉　吴剑雄.湖南师范大学附属长沙医院血液肿瘤科，湖南长沙　40006；.中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院病理科，湖南长沙　40006

中高危MDS与MDS/MPN患者骨髓单个核细胞凋亡及临床特征比较

刘小柳1邹立新1雷坚2张曙辉1吴剑雄1
1.湖南师范大学附属长沙医院血液肿瘤科，湖南长沙410006；
2.中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院病理科，湖南长沙410006

目的 比较中高危骨髓增生异常综合征（MDS）与骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤（MDS/MPN）骨髓单个核细胞（BMNCs）凋亡情况及其与患者临床特征的关系。方法 收集2013年7月～2015年7月在湖南师范大学附属长沙医院血液科就诊的8例中高危MDS及5例MDS/MPN患者的骨髓标本及临床资料，AO/EB荧光双重染色及Caspase-3活性检测BMNCs凋亡，相关性分析细胞凋亡与患者临床特征的关系。结果 凋亡在中高危MDS和MDS/MPN患者BMNCs中的发生率分别为（10.25±1.77）%、（6.90±1.66）%，前者高于后者（P=0.032）；Caspase-3检测显示，中高危MDS患者BMNCs中Caspase-3活性为（0.18±0.04）%，显著高于MDS/MPN组［（0.07±0.02）%］，差异有统计学意义 （P=0.028）；相关性分析显示，中高危MDS患者BMNCs凋亡率与骨髓原始细胞比例呈负相关（r=-0.81，P=0.015），而MDS/MPN凋亡率与骨髓原始细胞比例呈正相关（r=0.90，P=0.037）。结论BMNCs凋亡率、Caspase-3活性在中高危MDS和MDS/MPN中明显不同，且BMNCs凋亡和骨髓原始细胞比例相关。

骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤；细胞凋亡

最新WHO将慢性髓系恶性肿瘤分为三大类：骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤（MDS/MPN）。MDS是一组起源于造血干细胞的异质性恶性克隆性疾病［1］，主要特征是骨髓无效造血和具有高危向急性髓系白血病演变的风险［2］。而MDS/MPN是一组临床表现、实验室检查与MDS和MPN重叠的髓系恶性肿瘤，包括慢性粒单核细胞白血病（CMML）、非典型慢性髓系白血病（aCML，BCR-ABL阴性）、青少年粒单核细胞白血病（JMML）及MDS/MPN无法分类型（MDS/MPN-U）四种类型［3］。

尽管MDS作为一种血液系统疾病已被医学界认可多年，但其发生的病理机制及疾病进展的分子基础仍不清楚，其中，细胞凋亡失调在MDS发生发展中发挥一定作用［4］。而MDS/MPN作为一种兼有病态造血和细胞增殖性质的髓系肿瘤，其病理机制目前更是知之甚少［5］，细胞凋亡在MDS/MPN患者中的作用鲜有报道。作为两种异质性疾病，患者骨髓细胞凋亡情况如何，尚需进一步研究确定。

为比较中高危MDS及MDS/MPN患者中的细胞凋亡发生情况，本研究以中高危MDS患者及MDS/ MPN患者的骨髓单个核细胞（BMNCs）为研究材料，分别采用细胞形态学凋亡细胞观察、Caspase-3活性检测方法比较两组患者细胞凋亡情况；同时观察了患者的临床及实验室检查特征，对其细胞凋亡和临床表型的关系进行了研究。

1　资料与方法

1.1一般资料

本研究收集2013年7月～2015年7月在湖南师范大学附属长沙医院血液科就诊的8例中高危MDS 及5例MDS/MPN患者资料，所有病例均为初治，获得患者知情同意。患者临床特点见表1。8例MDS患者，依据患者临床特征、外周血象、骨髓细胞形态学、骨髓组织病理学、细胞及分子遗传学分析，诊断依据2006年维也纳诊断标准［6］，分型依据2008WHO标准［7］，危险度分组按照最新修订的IPSS-R标准［8］。其中，难治性贫血伴原始细胞增多-1型（RAEB-1）3例，难治性贫血伴原始细胞增多-2型（RAEB-2）5例；中危组2例，高危组3例，极高危组3例。5例MDS/MPN患者，诊断分型依据2008WHO标准［3］，其中，CMML 2例，MDS/ MPN-U 3例。

1.2方法

采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法对肝素抗凝骨髓标本进行分离，分离出的骨髓单个核细胞制成细胞悬液后分别用于细胞凋亡检测及Caspase-3凋亡蛋白酶活性检测。

1.2.1吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）荧光染料双重染色法检测细胞凋亡在荧光显微镜下，正常细胞核染色质着绿色，结构正常；早期凋亡细胞核染色质着绿色，但核呈固缩或串珠状；晚期凋亡细胞核染色质着橘红色，呈固缩状或斑块状；坏死细胞为核染色质呈红色，核结构正常［9］。镜下每个样本计数200个细胞，计算凋亡百分率。凋亡百分率=（凋亡细胞数/200）×100%。

1.2.2Caspase-3活性检测 根据R&D公司提供的Caspase-3活性检测试剂盒说明书进行。收集细胞，加入裂解液，冰上裂解10～20min，4℃12 000 r/min离心1 min，取5μL上清用Bradford法进行蛋白定量，即采用分光光度计测定OD595光密度值。另外45μL加50μL 2×反应缓冲液及5μL Caspase-3反应底物，于96孔板中 37℃避光孵育1～2 h，采用酶标仪测定OD405光密度值。按下述公式计算：Caspase-3相对活性=OD405/OD595。

表1　MDS和MDS/MPN患者的临床特征

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；若方差不齐，则用Mann-Whitney U非参数检验进行统计学分析；数值变量的相关性分析采用Spearman相关分析。选择双向检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1中高危MDS与MDS/MPN患者BMNCs凋亡水平比较

中高危MDS组BMNCs凋亡率为（10.25±1.77）%，MDS/MPN组为（6.90±1.66）%，中高危MDS组BMNCs凋亡率高于MDS/MPN组（P=0.032）。见图1。 2.2中高危MDS与MDS/MPN患者BMNCs中Caspase-3活性比较

图1　MDS和MDS/MPN患者BMNCs凋亡率比较

MDS组BMNCs中Caspase-3相对活性为（0.18± 0.04）%，MDS/MPN组Caspase-3相对活性为（0.07± 0.02）%，MDS组BMNCs中Caspase-3相对活性高于MDS/MPN组（P=0.028）。见图2。

图2　MDS和MDS/MPN患者Caspase-3活性比较

2.3细胞凋亡与患者临床特征的相关性分析

中高危MDS患者BMNCs凋亡率与骨髓原始细胞比例呈负相关 （r=-0.81，P=0.015）（图3A），而MDS/MPN患者BMNCs凋亡率与骨髓原始细胞比例呈正相关（r=0.90，P=0.037）（图3B）。但未发现患者骨髓细胞凋亡与其染色体核型异常、外周血细胞减少程度指标相关。

图3　BMNCs凋亡与骨髓原始细胞比例的相关性分析

3　讨论

染色体异常为MDS重要特点之一［10］，本研究MDS病例中也发现-7、+8、5q-核型异常；并且在MDS/MPN患者中也发现-7、+8、+9核型异常，但具体哪些基因发挥关键作用尚不明确，这些基因异常是疾病的始因还是伴随表现也尚不清楚。尽管MDS和MDS/MPN被认为是独立疾病，但患者表现出重叠的染色体异常［11］，提示两种疾病可能存在一部分共有的发病机制。

作为一种具有增殖性质的血液系统疾病，虽有研究发现在MDS/MPN中有部分CMML和MDS/MPN-U患者存在JAK2突变［3］，但与MPN不同的是，大多数MDS/MPN的增殖与RAS/MAPK信号通路相关。本研究收集的5例MDS/MPN中，发现1例患者出现JAK2突变阳性。

目前发现细胞凋亡失调、造血微环境异常、免疫失调、表观调节异常、染色体改变等因素参与MDS的发生发展［12-14］，其中，低危MDS表现为骨髓祖细胞凋亡的增加、进展期MDS骨髓细胞凋亡减少而增殖增加［15］，提示随着疾病进展，克隆细胞获得逃避凋亡信号的能力。因MDS/MPN患者整体预后较差［16］，作为比较本研究选取中高危MDS患者，通过凋亡研究发现其凋亡率约10.25%，符合大宗研究趋势［17］，并且在中高危MDS患者中随着骨髓原始细胞比例的增加，细胞凋亡减少。

Caspase-3在细胞凋亡中发挥重要作用，是外源性（死亡受体）和内源性（线粒体和内质网）凋亡通路的共同凋亡蛋白酶［18］，激活后通过抑制多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的活性，进而活化核酸内切酶，裂解核小体间的DNA，导致细胞凋亡［19］。本研究从形态学观察和凋亡蛋白酶生物活性研究两方面发现MDS患者骨髓单个核细胞凋亡发生率高于MDS/MPN患者，提示MDS/MPN是不同于MDS的另外一种血液系统克隆性疾病。

同时通过分析患者骨髓单个核细胞凋亡与患者临床特征的关系发现，MDS患者中骨髓单个核细胞凋亡率与骨髓原始细胞比例呈反比，但MDS/MPN患者中BMNCs凋亡率却与骨髓原始细胞比例呈正相关，考虑可能与以下因素相关：①MDS/MPN是独立于MDS的一种髓系恶性肿瘤，细胞生物学活性不同于MDS克隆；②本研究病例数有限，尚需进一步进行临床病例收集及研究。但本研究未发现患者细胞凋亡与其染色体核型异常、外周血细胞减少程度相关。

本研究从细胞分子水平初步比较了MDS与MDS/MPN两类慢性髓系肿瘤中BMNCs的凋亡情况，并探讨了骨髓细胞凋亡与患者临床特征的相关性，为MDS及MDS/MPN的病理机制研究提供相关实验依据。但MDS与MDS/MPN两类疾病发病机制中存在共同及不同之处，细胞凋亡与增殖对MDS及MDS/ MPN患者的临床表型、治疗反应和预后的影响等问题仍需要大量临床及实验室研究来解决。

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Comparison of apoptosis of bone marrow mononuclear cells and clinical features in patients with advanced MDS and MDS/MPN

LIU Xiaoliu1ZOU Lixin1LEIJian2ZHANG Shuhui1WU Jianxiong1
1.Department of Hematology，Changsha Hospital Affiliated to Hu'nan Normal University，Hu'nan Province，Changsha 410006，China；2.Department of Pathology，the Affiliated Tumor Hospital，Xiangya School of Medicine，Central South University，Hu'nan Province，Changsha410006，China

Objective To compare the apoptosis of bone marrow mononuclear cells （BMNCs）in myelodysplastic syndrome（MDS）and myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms（MDS/MPN），and analyze the relationship between apoptosis and clinical characteristics of patients.Methods Bone marrow specimens and clinical data of 8 cases of intermediate/high risk MDS and 5 cases of MDS/MPN patients were collected from July 2013 to July 2015 in Department of Hematology，Changsha Hospital Affiliated to Hu'nan Normal University.Acridine orange/ethidium bromide fluorescence staining and Caspase-3 activity assay were used to detect apoptosis of BMNCs，and the correlation between apoptosis and clinical characteristics of patients was analyzed.Results The apoptotic rate in intermediate/high risk MDSand MDS/MPN patients were（10.25±1.77）%，（6.90±1.66）%respectively，the former was higher than the latter（P= 0.032）.Caspase-3 activity assay showed that the Caspase-3 activity of intermediate/high risk MDSBMNCs was（0.18± 0.04）%，significantly higher than that of the MDS/MPN group［（0.07±0.02）%］，with statistically significant difference （P=0.028）.Correlation analysis showed that negative correlation was found between BMNCs apoptosis and bone marrow blast cell percentage in intermediate/high risk MDS patients（r=-0.81，P=0.015），but BMNCs apoptotic rate and the proportion of bone marrow blast cells was positively correlated in MDS/MPN patients（r=0.90，P=0.037）.Conclusion The apoptotic rate and Caspase-3 activity are significantly different in intermediate/high risk MDS and MDS/MPN，and there is a correlation between apoptotic rate and bone marrow blasts.

Myelodysplastic syndrome；Myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms；Apoptosis

R551.3

A

1673-7210（2016）01（b）-0004-04

2015-10-11本文编辑：程铭）

国家自然科学基金资助项目（81500141）。

刘小柳（1983.1-），女，博士；研究方向：恶性血液病的分子机制。