稳定过表达m icroRNA-96前列腺癌细胞株的建立及其对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响

李勇波　张孝斌　程　帆　饶　婷　余伟民武汉大学人民医院泌尿外科，湖北武汉　430060

稳定过表达m icroRNA-96前列腺癌细胞株的建立及其对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响

李勇波张孝斌程帆饶婷余伟民
武汉大学人民医院泌尿外科，湖北武汉430060

目的 构建稳定过表达microRNA-96（miR-96）的前列腺癌DU-145细胞株并研究其对DU-145细胞增殖和迁移的影响。方法 构建miR-96慢病毒表达载体并转染前列腺癌细胞DU-145，嘌呤霉素筛选出稳定表达miR-96（实验组）及阴性对照（对照组）的细胞株；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测转染后两组细胞miR-96的表达；克隆形成实验和MTT实验检测两组的细胞增殖情况。transwell迁移实验检测两组细胞的迁移能力。结果经过筛选后各组转染细胞发光效率均＞90%；qRT-PCR结果显示实验组miR-96表达水平明显高于对照组（P＜0.05）；克隆形成实验显示实验组克隆形成率明显低于对照组（P＜0.05）；MTT实验显示实验组各个时间点吸光度值均低于对照组（P＜0.05）；transwell迁移实验表明实验组穿膜细胞数明显少于对照组（P＜0.05）。结论 miR-96可抑制前列腺细胞的增殖和迁移能力，可能参与前列腺癌的发生、发展。

前列腺癌；m icroRNA-96；增殖；迁移

前列腺癌是一种常见恶性泌尿系统肿瘤，全球范围内每年约有20万例患者死于前列腺癌［1］。前列腺癌的发病原因迄今仍不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源性基因编码，长度为19～22个核苷酸的非编码小分子单链RNA。目前，研究发现，miRNA在多种肿瘤中异常表达［2-5］，与恶性肿瘤关系密切，大约有调控miRNA编码基因位的52%位于肿瘤相关染色体区域［6］。已有研究证明，miR-96在多种肿瘤中低表达，如：膀胱癌、乳腺癌、直肠癌等，是潜在的肿瘤抑制因子［7-11］。本实验通过构建过表达miR-96的慢病毒载体来感染前列腺癌DU-145细胞株，以构建过表达miR-96的前列腺癌细胞稳转细胞株，并分别进行克隆形成实验、MTT实验、transwell迁移实验，研究miR-96对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响。

1　材料与方法

1.1m iR-96慢病毒质粒构建与包装

实验所需重组穿梭质粒LV3和包装质粒均由上海吉玛制药技术有限公司制备。LV3质粒携带荧光蛋白表达基因及嘌呤霉素抗性基因。miR-96基因片段的导入及病毒包装由上海吉玛制药技术有限公司完成。基因片段序列分别如下。miR-96：5′-TTGTGCTTGATCTAACCATGT-3′；阴性对照：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′。经基因测序确定序列导入成功。

1.2细胞培养

前列腺癌细胞株：DU-145（购自中科院上海细胞库），用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基，按常规方法培养及传代。胎牛血清（Gib co）、青霉素和链霉素（北京索莱宝科技有限公司）；1640培养基（Gibco）、0.25%胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；嘌呤霉素粉剂（北京索莱宝科技有限公司）；普通显微镜及荧光显微镜（日本Olympus）；荧光定量PCR仪（日本Olympus）。

1.3嘌呤霉素筛选浓度的确定

生理盐水配制终浓度为0.5 g/L的嘌呤霉素溶液，并用0.22μm过滤器过滤；筛选前1 d接种5.5× 104个细胞至24孔板中，加入500μL完全培养基，37℃、5%的CO2条件下培养至细胞融合度达40%～50%；按梯度浓度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4 mg/L）嘌呤霉素溶液加入24孔板中，每隔1 d换新鲜含嘌呤霉素的溶液（浓度不变），培养3 d，使DU-145细胞全部死亡的嘌呤霉素最低浓度即为筛选浓度。嘌呤霉素的最佳筛选浓度为1.6mg/L。

1.4慢病毒载体感染前列腺癌细胞

慢病毒感染细胞前1 d接种4.0×103个DU-145细胞于96孔板中，100μL完全培养基培养，37℃、5% 的CO2条件下培养至细胞融合度达60%～70%；吸弃旧培养基，加入90μL新鲜培养基，然后加入滴度为1×107TU/mL的病毒液。24 h后更换新鲜培养基，继续培养；48 h后荧光显微镜下观察细胞发光情况。

1.5稳转株的筛选及荧光效率检测

慢病毒感染细胞后，待96孔板中的细胞完全融合，将细胞转移到6孔板中培养，加入浓度为1.6 mg/L的嘌呤霉素的培养基1mL。每24小时换新鲜含筛选浓度嘌呤霉素的完全培养基，荧光显微镜下（200×）观察荧光表达情况。筛选2周后获得稳定表达细胞株。筛选培养期间根据细胞的生长状况进行传代。

1.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测m iR-96的表达

获得稳定表达细胞株后，分别提取实验组和对照组的RNA，RNA抽提使用QuantoBio Total RNA Isolation Kit（Tiangen公司）进行，利用PrimeScriotTMRT reagent Kit（TaKaRa公司）逆转录试剂盒进行cDNA第一条链的合成，反应条件为37℃、15min，85℃、5 s；以第一条链cDNA为模板，利用SYBR Green PCR MasterMix（Tiangen公司）进行PCR扩增，反应在20μL的体系中进行，扩增条件为预变性：95℃×15min，1个循环；变性：95℃×10 s，40个循环；退火/延伸：60℃×32 s，40个循环。U6 snRNA作为实验的内参基因。miRNA相对表达量2-ΔΔCt，ΔCt=（CtmiRNA-CtU6）。逆转录引物为试剂盒内通用引物。扩增引物：miR-96上游：5′-TCTGGGTACCGCACTGGTAGAATTCACTG-3′；下游：5′-CCTTTCTAGACCACGGCACCATTCAGGA-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7克隆形成实验

获得实验组和对照组的稳转细胞株后，消化生长对数期细胞，调整浓度为800个/mL，取1 mL细胞分别接种于6孔板中，37℃、5%CO2培养箱培养；每3天更换1次培养液。培养10 d后，吸弃每孔培养液，0.5%结晶紫染色显微镜下（200×）计数克隆数。每大于50个细胞的集落计数为1个克隆团，克隆形成率=（克隆团数/铺板细胞数）×100%，实验重复3次。

1.8MTT实验

消化生长对数期的各组细胞，调整浓度分别为1.0×103个/mL，分别于接种后24、48、72、96 h将每孔加入MTT溶液（浓度0.5mg/mL），继续培养箱培养4 h后吸弃孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，37℃恒温摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。置于酶联免疫检测仪490 nm波长处测量各孔OD值，实验重复3次。

1.9transwell迁移实验

消化生长对数期各组细胞，无血清培养基调整细胞浓度为1.0×106个/mL，，每个小室上室加150μL细胞悬液，下室加600μL含10%血清的培养基，37℃、5%CO2培养箱培养8 h。取出小室，甲醇固定后用0.1%结晶紫染色，切下底膜移至载玻片上，用中性树胶封片，在显微镜下（200×）随机取5个视野计数穿透滤膜的细胞数，取平均值。1.10统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1实验组与对照组荧光显微镜下稳转细胞株的发光情况

经过扩大培养和嘌呤霉素筛选2周后得到稳定转染株，荧光显微镜同一高倍镜视野下观察细胞发光情况，实验组与对照组发光细胞数均＞90%。见图1。

图1　实验组与对照组荧光显微镜与非荧光显微镜下稳转细胞株的发光情况（200×）

2.2实验组与对照组细胞中m iR-96的表达情况

qRT-PCR检测实验组和对照组中miR-96的表达情况，实验组miR-96的表达明显高于对照组，倍数改变为 5.937±0.129，差异有统计学意义 （P= 0.0002）。见图2。miR-96在DU-145细胞中成功稳定过表达。

图2　实验组与对照组细胞中m iR-96的表达情况

2.3实验组与对照组的克隆形成情况

培养10 d后，实验组与对照组细胞固定染色克隆形成情况见图3，实验组和对照组的克隆形成率分别为（9.67±2.52）%、（30.52±4.51）%，差异有统计学意义（P=0.0034），见图4。miR-96可以明显抑制DU-145的克隆形成。

图3　实验组与对照组的克隆形成情况（结晶紫染色法,200×）

图4　实验组与对照组克隆形成率比较

2.4实验组与对照组的细胞增殖情况

实验组与对照组细胞于接种后连续4 d测吸光度值，实验组的吸光度值分别为 0.1677±0.0047、0.2047±0.0090、0.2631±0.0083、0.3480±0.0054，对照组吸光度值分别为0.1683±0.0069、0.2790±0.0034、0.4285± 0.0031、0.4971±0.0046，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。miR-96在各个时间点均可抑制DU-145细胞的增殖。2.5实验组与对照组的穿膜细胞情况

图5　实验组与对照组的细胞增殖情况

培养8 h后，固定染色，高倍显微镜下实验组与对照组的穿膜细胞情况见图6。实验组和对照组穿膜细胞数分别为（85.00±11.52）、（190.70±13.57）个，差异有统计学意义（P=0.0052），说明miR-96可抑制DU-145细胞的迁移能力。

图6　实验组与对照组的穿膜细胞情况（结晶紫染色法,200×）

3　讨论

近年来，大量癌性相关miRNA分子与多种信号通路或转录因子存在交互作用共同参与肿瘤的发生、发展。随着对miRNA调控及肿瘤相关信号通路研究的深入，以干扰oncomiRs表达为基础的策略将为肿瘤的治疗提供广阔的前景。miRNA可通过与靶基因mRNA的特异性碱基配对，引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制，从而调控转录后基因的表达［12］，能降调节其相应的蛋白编码的靶基因。到目前为止，已有706个人类miRNA被鉴定。miRNA与多种肿瘤的发生存在密切关系，在多种癌细胞中有miRNA的异常表达或突变。miRNA既可作为抑癌基因，下调原癌基因的活性，又可作为癌基因，下调抑癌基因的活性。生物信息和实验研究已经显示，成千上万的蛋白编码的基因共同由miRNA调节。研究已表明，miRNA在人类的许多生物过程中发挥着重要作用，如代谢、分化、细胞增殖和细胞凋亡［13-14］。一些miRNA在肿瘤组织中表达异常，参与了肿瘤的发生和发展。多数在肿瘤中高表达的miRNA起着癌基因的作用，而低表达或表达缺失的miRNA在肿瘤中起抑癌基因的作用。有研究发现，失调的miRNA与肿瘤的起源和进展相关，表明miRNA在癌症诊断和预后中可以作为一种生物标志物［15-16］。尽管对miRNA功能的理解有很大的进展，但miRNA在前列腺癌中的作用尚不清楚。

病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，其优点在于它能够感染多种难感染的细胞，比如原代细胞、干细胞、神经元细胞等，而且慢病毒能够将外源基因插入细胞基因组内，实现长时间、稳定表达外源基因。慢病毒介导的miRNA过表达载体的构建及其稳转细胞株的建立，使实验研究一劳永逸。本实验构建过表达miR-96的慢病毒载体感染前列腺癌细胞株DU-145，从而获得稳定过表达miR-96的稳转细胞株。

本实验构建的慢病毒载体的穿梭质粒带有嘌呤霉素的抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）表达基因及miR-96或阴性对照基因片段。当慢病毒感染细胞后，miR-96或阴性对照基因及嘌呤霉素的抗性基因和GFP基因可整合进入宿主基因组并稳定表达。这样宿主细胞在实现过表达miR-96或阴性对照的同时也具有嘌呤霉素抗性和表达GFP。通过嘌呤霉素分别作用于DU-145细胞，得到其最佳的筛选浓度。进行嘌呤霉素压力筛选时未感染的细胞或嘌呤霉素基因表达缺失的细胞将会被杀死，用筛选浓度连续培养2周，同一高倍镜视野下观察细胞发光情况，发光细胞数均＞90%。最后分别提取了三株细胞实验组和对照组RNA，通过qRT-PCR来检测其miR-96的表达情况，结果显示，实验组miR-96的表达要明显高于对照组，说明miR-96在细胞中成功稳定过表达。

生长快、远处转移和侵袭性是肿瘤细胞的特性，远处转移是导致晚期前列腺癌患者死亡的主要原因［17］。因此早期发现肿瘤，并抑制其生长和转移是治疗肿瘤的关键。近年随着miRNA研究的不断深入，发现大量异常表达的miRNA通过调控靶基因的表达而调节多种恶性肿瘤的发生、发展，因此大规模地筛选肿瘤发生、发展过程中异常表达的miRNA，将为人们全面认识肿瘤的生物学特性发挥重要作用［18］，也为前列腺癌的早期诊治提供了新的希望。miRNA发挥生物学调控的机制为：成熟的miRNA与调节蛋白Argonaute2（Ago2）结合，进入RNA诱导的沉默复合体，通过降解靶mRNA、抑制靶mRNA翻译或使靶mRNA脱腺苷化而发挥作用［19］。多数miRNA具有高度时序性、保守性和细胞组织特异性，同时受到发育和空间调控，从而参与细胞的增殖、分化和死亡过程［20-21］。有研究认为，miRNA可作为癌基因或抑癌基因而发挥作用，miRNA可能成为诊断肿瘤的新的分子标志和判断肿瘤治疗及预后的分子靶点［22］，miR-96通过调控不同靶基因影响多种肿瘤细胞的生物功能。Kriebel等［23］、Siu等［24］研究发现，泌尿上皮肿瘤患者血清中miR-96的水平异常，推测miR-96可能成为泌尿上皮肿瘤诊断和预后分析的肿瘤标志物。本研究通过transwell迁移实验发现，miR-96可抑制前列腺癌细胞的迁移能力，通过细胞克隆形成实验和MTT实验表明，miR-96可抑制前列腺癌细胞DU-145的增殖，初步实验表明，miR-96可调控前列腺癌细胞的生物过程，但具体调控机制有待进一步研究。

总之，成功构建了稳定过表达miR-96的前列腺癌细胞株，为以后分析miR-96对前列腺癌生物学功能影响的研究奠定了基础。增殖实验表明，miR-96可抑制前列腺癌细胞DU-145的增殖，为诊断和治疗前列腺癌提供了新的方向。

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Establishing of microRNA-96 stable overexpression cell lines of prostatic cancer and its effect on proliferation and migration of prostatic cancer cells

LIYongbo ZHANG XiaobinCHENG FanRAO Ting YUWeimin
Department of Urology，People′s Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan 430060，China

Objective To establish microRNA-96（miR-96）stable overexpression cell lines of cervical cancer and detect its effect on proliferation of prostatic cancer cell lines DU-145.Methods Lentiviral vector stable overexpressing miR-96 was constructed and prostatic cancer cell lines DU-145 were transfected（experimental group）.The transfection cells were screened by using of puromycin and the stable transfection cell lines were obtained（control group）.Endogenous miR-96 levels in two groups were measured by quantitative RT-PCR（qRT-PCR）.The proliferation of DU-145 cells in two groups were detected by clonogenic proliferation assay and MTT assay.The migration of DU-145 cells in two groups were assessed by trans well assay.Results After screening，luminous efficiency rate of trans fection cell in each group was over 90%.qRT-PCR showed that the expression level of miR-96 in experimental group was significantly higher than that in control group（P＜0.05）.Colony formation assay showed that the clonogenicity rate of experimental group was significantly lower than that of control group（P＜0.05）.MTT assay demonstrated that absorbance values all time points of experimental group were lower than those of control group（P＜0.05）.Trans well assay revealed that the number of cells through the well in experimental group were less than that in control group（P＜0.05）.Conclusion miR-96 can inhibit proliferation and migration of prostatic cancer cells and may be involved in the development of prostatic cancer.

Prostatic cancer；MicroRNA-96；Proliferation；Migration

R737.25

A

1673-7210（2016）01（b）-0024-05

2015-06-15本文编辑：李亚聪）

李勇波（1988.5-），男，武汉大学人民医院泌尿外科专业2013级在读硕士研究生；研究方向：泌尿系肿瘤。

张孝斌（1944.9-），男，教授，主任医师；研究方向：泌尿系肿瘤及结石。