子痫前期患者胎盘组织中HSP70和NF-κB的表达及意义

林培红　胡继芬福建医科大学附属福州市第一医院妇产科，福建福州　350009

子痫前期患者胎盘组织中HSP70和NF-κB的表达及意义

林培红胡继芬
福建医科大学附属福州市第一医院妇产科，福建福州350009

目的 探讨子痫前期患者胎盘组织中HSP70和NF-κB的表达差异及意义。方法 选取2013年12月～2015年1月在福建医科大学附属福州市第一医院住院分娩的65例孕妇为研究对象，其中正常妊娠25例（正常妊娠组），轻度子痫前期17例（轻度子痫前期组），重度子痫前期23例（重度子痫前期组）。采用免疫组化法及实时荧光定量PCR检测孕妇胎盘HSP70和NF-κB的表达，并分析HSP70与NF-κB的相关性。 结果 免疫组化结果提示：HSP70及NF-κB在正常妊娠组、轻度子痫前期组及重度子痫前期组患者胎盘组织中的染色程度依次增高，轻度及重度子痫前期组HSP70及NF-κB阳性表达率与正常妊娠组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01），但轻度及重度子痫前期组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；实时荧光定量PCR结果提示：与正常妊娠组比较，HSP70及NF-κB在轻度子痫前期组及轻度子痫前期组中的表达水平增高，轻度子痫前期组及重度子痫前期组与正常妊娠组两两比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。相关性分析结果显示，HSP70与NF-κB呈正相关（r=0.692，P＜0.01）。结论 子痫前期患者胎盘组织中HSP70和NF-κB表达增加，可能与子痫前期的发生、发展有关。

子痫前期；胎盘组织；热休克蛋白70；核因子-κB

子痫前期是妊娠期特发疾病，发生率为2%～6%［1］，可引起母婴不良结局［2］，其发病机制是产科探讨研究的热点。目前主要观点有：遗传易感、免疫机制、胎盘缺血及缺氧、营养缺乏、胰岛素抵抗、炎性反应和氧化应激、细胞因子的异常表达、基因突变或基因多态性等［3-6］。热休克蛋白70（HSP70）和核因子-κB（NF-κB）在胚胎着床和发育、调节内皮功能方面、炎性反应和氧化应激等均有一定的作用，提示其可能与子痫前期发病密切相关。本课题拟采用免疫组化方法及RTPCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）方法检测子痫前期和正常妊娠妇女胎盘HSP70与NF-κB表达情况，探讨二者的变化及与子痫前期的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2013年12月～2015年1月在福建医科大学附属福州市第一医院住院并分娩病例65例，其中正常妊娠组25例；子痫前期组40例，其中包括轻度子痫前期组17例，重度子痫前期组23例。研究对象年龄、终止妊娠孕龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。子痫前期的诊断参考谢幸及苟文丽主编的第8版《妇产科学》［7］。所有产妇均为单胎妊娠，排除其他产科并发症及合并症。本研究已经过医院伦理委员会批准，参与者均知情同意。

表1　三组研究对象相关临床资料比较（±s）

表1　三组研究对象相关临床资料比较（±s）

组别　例数　年龄（岁）　孕龄（周）正常妊娠组轻度子痫前期组重度子痫前期组P值25 17 23 27.9±4.05 25.4±6.60 29.6±5.65 ＞0.05 38.94±1.49 38.59±1.45 38.02±1.67 ＞0.05

1.2方法

1.2.1取材胎盘娩出后，立即取胎盘脐带附着处母体面的全层胎盘组织2块，无菌下生理盐水反复漂洗吸干，其中一块固定于10%中性多聚甲醛溶液，脱水后石蜡包埋。另一块取约100mg置入冻存管保存于液氮。

1.2.2HSP70蛋白检测免疫组化采用MaxVisionTM一步法，兔抗人HSP70多克隆抗体及兔抗人NF-κB p65多克隆体，为英国Abcam公司生产。MaxVisionTM试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。每张切片随机选取5个高倍视野得分取平均值统计。结果判定按半定量法，①染色强度分级评分：细胞内无着染色、着色不清、与背景一致为0分；见少量淡黄色颗粒，高于背景为1分；见较多深棕色颗粒为2分；见大量棕黄色或棕褐色颗粒为3分。②阳性细胞百分率评分：无阳性细胞为0分；＜25%为1分；25%～50%为2分；＞50%为3分。取以上两项乘积：积分0～3分为（-）；4～9分为（+）。

1.2.3RT-PCR检测NF-κB p65表达采用Trizol法提取总RNA。将组织总RNA逆转录为cDNA（互补脱氧核糖核酸），然后设计特异性引物和Sybr Greenl荧光染料进行荧光定量PCR检测。设置β-actin为内参照。PCR扩增条件的设置：94℃4 min，94℃20 s，60℃30 s，72℃30 s，循环35次，72℃检测信号。引物分别为：HSP70：正义链：5’-CAGAACACCGTGTTTGACGC-3’，反义链：5-CTCCTCGGGGTAGAATGCC-3’；NF-κB p65：正义链：5’-GTGGGGACTACGACCTGAATG-3’，反义链：5’-GCACGATTGTCAAAGATGGGA-3’；内参β-actin：正义链：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，反义链：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，以上引物均为上海闪晶分子生物科技有限公司设计合成，经Genebank检索为特异性引物。反应结束后确认HSP70 mRNA、NF-κB p65 mRNA的Real-Time PCR扩增曲线和溶解曲线。利用ABI 7300系统进行分析，采用2-△Ct法计算目的基因在每个模板中的平均相对含量。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关关系采用直线相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1免疫组化结果

2.1.1HSP70在胎盘组织中的表达HSP70主要定位于合体滋养细胞胞浆，部分核着色。轻度子痫前期组表达细胞数增加，阳性颗粒增多，着色加深；重度子痫前期组染色进一步加深。统计分析提示：正常妊娠组、轻度子痫前期组及重度子痫前期组患者染色程度依次增高，轻度及重度子痫前期组阳性表达率与正常妊娠组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01），但轻度子痫前期组与重度子痫前期组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

2.1.2NF-κB p65在胎盘组织中的表达NF-κB p65主要定位于胎盘的合体滋养细胞、血管内皮的细胞浆和细胞核。正常妊娠组可见少量阳性细胞，主要表达于合体滋养细胞胞浆，胞核内极少；轻度子痫前期组阳性颗粒明显增多，着色加深，胞核内表达明显增加；重度子痫前期组染色进一步加深，大部分合体滋养细胞、血管内皮细胞胞浆均有表达，胞核内表达进一步增加。统计分析提示：正常妊娠组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组染色程度依次增高，轻度子痫前期组及重度子痫前期组与正常妊娠组比较差异有统计学意义（P＜0.01），但轻度子痫前期组与重度子痫前期组患者比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表2。

图1　HSP70在胎盘组织中的表达（免疫组化,400×）

图2　NF-κB p65在胎盘组织中的表达（免疫组化,400×）

表2　　各组胎盘组织中HSP70与NF-κB p65表达水平比较（例）

2.2RT-PCR结果

2.2.1HSP70mRNA及NF-κB p65mRNA表达情况 正常妊娠组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组HSP70 mRNA及NF-κB p65mRNA逐渐升高，且组间两两比较差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。见表3。

2.2.2HSP70 mRNA与NF-κB p65 mRNA相关性分析HSP70mRNA的表达与NF-κB p65 mRNA的表达呈正相关（r=0.692，P＜0.01）。

表3　各组胎盘组织中HSP70 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达情况比较

3　讨论

HSP是指热休克反应中转录合成的一组蛋白，在各种不利于自身的因素刺激下，均可诱导细胞快速翻译合成，启动内源性保护机制，维持机体内环境的稳定，发挥抗损伤的应激保护效应［8-9］。根据其分子量大小的不同，HSP可分为：HSP27及泛素、HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族和 HSP110家族［10］，其中HSP70是最保守、含量最丰富的一类，可诱导性最强。人类发生应激时主要合成HSP70。子痫前期胎盘缺血缺氧，导致生成的活性氧增加，促进多种细胞因子的释放，导致各种蛋白质变性损伤，激活热休克反应［11］。此时，HSP70作为分子伴侣，可保护多肽的结构和功能。HSP70的内源性保护机制可能是：①稳定细胞膜：HSP70可与细胞质膜结合，稳定质膜，维持细胞结构、功能的正常。②抗氧化作用：通过抑制NADPH氧化酶的功能，减少氧自基的产生，同时促进内源性过氧化酶的表达，清除氧自由基，对抗氧化应激，保护细胞［12］。③增加正常蛋白的合成：HSP70与ATP高度亲和，水解ATP所释放的能量能帮助细胞合成正常的蛋白，促进蛋白损伤的修复，清除变性、无法修复的蛋白，恢复受损核仁的结构［13-14］。④分子伴侣：HSP70有助于蛋白质的正确折叠。⑤抑制凋亡：HSP70可直接抑制促细胞凋亡蛋白的功能，从而抑制细胞凋亡［15］，减轻子痫前期时器官损伤。但是HSP70的表达增加并不能完全阻止子痫前期病情的发生和进展，Shall等［16］研究发现妊娠期高血压疾病患者胎盘细胞HSP70的过度表达并不能提高其抗凋亡能力，反而造成细胞线粒体通透性增加，加速细胞凋亡。

NF-κB是一种转录因子，普遍存在于各种类型的组织和细胞，在细胞受到刺激时可被诱导激活，继而激活多种重要前炎症因子，使之转录活化。有活性的NF-κB以二聚体形式存在，最常见的是p50和p65的异二聚体。测定NF-κB p65的表达可代表NF-κB的活化程度。在炎症和氧化应激的刺激下NF-κB活化，活化的NF-κB可使表皮生长因子、血小板生长因子等生长因子高表达，传递引起平滑肌细胞增殖、血管重建的膜内信号，从而使细小动脉胶原纤维、管壁厚度、平均动脉压增加，导致高血压、蛋白尿等一系列子痫前期的症状［17-20］。有研究亦发现重度子痫前期患者胎盘组织中NF-κB表达增加［21-22］。

本研究结果显示，HSP70、NF-κB在子痫前期胎盘组织中具有相关性，呈正相关改变，提示两者均参与了子痫前期的发生、发展。HSP70作为子痫前期的内源性保护分子之一，NF-κB作为子痫前期级联反应的重要信号转导因子，可研究如何从基因角度上抑制NF-κB的激活及有效地诱导HSP70生成，作为子痫前期预防和治疗的新手段，这也将为临床提供不同的治疗思路及途径。

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Expression of HSP70 and NF-κB in the placental trophoblasts of pregnant women com plicated with preeclampsia

LIN PeihongHU Jifen
Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fujian Province，Fuzhou350009，China

Objective To investigate the difference and significance between the expression of HSP70 and NF-κB in the placenta tissues of normal pregnancy and preeclampsia patients，in order to find out the relation between HSP70 and NF-κB.Methods From December 2013 to January 2015，65 pregnant patients in the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University were selected.There were 25 healthy pregnant women（normal pregnant group），17 mild preeclampsia patients（mild preeclampsia group）and 23 severe preeclampsia patients（severe preeclampsia group）.The expressions of HSP70 and NF-κB in the placental tissues were measured using immunohistochemistry methods and real-time fluorescence quantitative PCR technique.Results HSP70 and NF-κB immunohistochemical results suggested that the staining degree of the normal pregnant group，the mild and severe preeclampsia group increased gradually.The differences of the expressions of HSP70 and NF-κB between the mild，severe preeclampsia group and the normal pregnant group were significant（P＜0.01），while there was no statistical difference between the mild preeclampsia group and the severe preeclampsia group（P＞0.05）；the results of HSP70 and NF-κB real-time fluorescence quantitative PCR suggested that，the level of the expression increased in mild preeclampsia group and severe preeclampsia group，as compared with the normal pregnant group，the difference between the mild preeclampsia group，severe preeclampsia group and the normal pregnant group was statistically significant（P＜0.01）.The results of correlation analysis showed that，the expression of HSP70 was positively correlated with NF-κB（r=0.692，P＜0.01）.Conclusion The expression of HSP70 and NF-κB increases in placental tissues of patients with preeclampsia，and may be associated with the occurrence and development of preeclampsia.

Preeclampsia；Placenta tissue；Heat shock protein 70；Nuclear factorκB

R714.246

A

1673-7210（2016）01（b）-0061-04

2015-10-18本文编辑：任念）

福建省福州市科技计划项目（2014-S-136-6）。

胡继芬（1958-），女，硕士生导师，主任医师；研究方向：围生医学。