宫颈癌组织中P—Akt的表达及其与HPV感染的关系探析

龚慧珍　王悦　潘伟文　吴线玲　季金英　谢军花　包甘芬

[摘要]目的：研究探讨宫颈组织中P-Akt的表达情况，并分析其与HPV感染之间的关系。方法：选取龙泉市人民医院和浙大妇产医院接受治疗并经病理诊断确诊为宫颈癌的患者35例作为研究对象，确诊后送往上级医院行手术治疗。手术前均行HPV-DNA检测，手术后上级医院采用免疫组化方法对其病变组织中的P-Akt表达情况进行测定，选择宫颈上皮内瘤变患者和慢性宫颈炎患者各35例作为对照，分别比较三组患者的P-Akt表达阳性率。并对宫颈癌和宫颈上皮内瘤变患者中HPV感染阳性与P-Akt表达阳性之间的关系进行比较。结果：宫颈癌患者、宫颈上皮内瘤变患者、慢性宫颈炎患者的P-Akt阳性表达率分别为97.1%、80.0%和20.0%，比较均有统计学差异（P<0.05）。宫颈癌和宫颈上皮内瘤变患者中，HPV感染阳性患者的P-Akt阳性表达率（95.2%）也显著高于HPV感染阴性的患者（28.6%），比较有统计学差异（P<0.05）。结论：P-Akt阳性表达与宫颈病变的程度、HPV感染之间都存在显著相关性。

[关键词]宫颈癌组织；P-Akt表达；HPV感染

[中图分类号]R737.33 [文献标志码]A

宫颈癌是妇科临床常见疾病，位居全球女性癌症发病率之首，且有逐年上升、年轻化的趋势，严重威胁女性的身体健康和生命安全。本文就龙泉市人民医院和浙大妇产医院收治的宫颈癌患者作为研究对象，探讨Akt的活化形式磷酸化蛋白激酶B（P-Akt）在肿瘤中的表达情况以及其与HPV病毒感染之间的相互关系。具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取龙泉市人民医院和浙大妇产医院2014年1月至2015年10月诊断为宫颈癌患者35例作为研究对象，所有患者均经手术病理诊断证实。参与本研究的患者均签署知情同意书。

纳入标准：患者在取材前均未接受任何治疗：年龄在18岁以上：且标本来源于手术后新鲜宫颈组织。排除标准：合并严重肝肾功能障碍的患者；合并免疫系统疾病的患者；有精神疾病病史的患者：合并血液系统疾病的患者。

宫颈癌患者的年龄在24岁到57岁之间，平均年龄为（39.6+3.3）岁。

同时，选择宫颈上皮内瘤变患者和慢性宫颈炎患者各35例作为对照，宫颈上皮内瘤变患者的年龄在22～56岁之间，平均（40.1±2.1）岁：慢性宫颈炎患者的年龄在21岁到58岁之间，平均（40.9±2.7）岁。

所有患者均送往上级医院接受治疗，在治疗前于我院接受过HPV-DNA检测，并在治疗后于上级医院行病变组织P-Akt表达检测，检测资料均完整准确。

1.2 方法

HPV-DNA检测：采集患者病变组织，使用PCR技术进行检测，严格按照亚能（深圳）生物科技有限公司生产的HPV核酸扩增分型检测试剂盒（生产批号YZB/国5128-2013）的操作要求，对HPV-DNA进行提取后，依次进行PCR扩增、杂交、显色，并观察检测结果。以相应片段长度处出现条带的情况为HPV感染阳性。

病变组织P-Akt表达检测：行手术治疗后于上级医院行病变组织P-Akt表达检测。采用免疫组化法进行检测。将获得的宫颈病变组织标本浸泡在10%的甲醛溶液中进行固定后，依次经补充固定、脱水透明、浸蜡、包埋等步骤对组织进行处理，制作石蜡块。将石蜡块切片，厚度为4μm，其中一张做常规HE染色，并在光镜下进行观察和诊断；另一张石蜡切片常规脱蜡、蒸馏水冲洗、PBS浸泡、高压修复（柠檬酸盐抗原修复液）、PBS多次冲洗、内源性过氧化酶阻断剂室温下孵育、PBS冲洗、羊非免疫血清室温孵育、除血清后依次加一抗（P-Akt1/2/3多克隆抗体）、二抗，经室温孵育、PBS冲洗后，向其中加入链霉菌抗生物索蛋白-过氧化酶，孵育、DAB染色、冲洗、复染、脱水、透明、封固后再光镜下观察。随机选取5个高倍视野（200个细胞），按照细胞的染色程度进行积分，以细胞无色记为O分，以细胞呈淡黄色记为1分，以细胞为棕黄色记为2分，以细胞为棕褐色记为3分。将光镜下细胞膜、细胞浆、细胞核有十分明显的棕黄色细颗粒判断为P-Akt表达阳性，并以阳性细胞数在5%以下记0分，在5%～25%之间记1分，在26%～50%之间记2分，在50%以上记为3分。计算其染色强度得分和阳性细胞数得分之间的乘积，并以积分≥3分P-Akt表达阳性，积分在0～2分之间为表达阴性。

1.3 统计学方法

本次实验数据采用SPSS12.0软件进行统计学分析，其中计量资料对比采用t检验，计数资料对比采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

比较宫颈癌患者、宫颈上皮内瘤变患者、慢性宫颈炎患者的P-Akt阳性表达率，可见其分别为97.1%、80.0%和20.0%，三组患者之间的比较均有统计学差异（p<0.05）。见表1。

宫颈癌和宫颈上皮内瘤变患者共计70例，其中，HPV检测阳性的患者63例，HPV感染阳性率为90.0%，其中P-Akt阳性表达患者60例，占95.2%；7例HPV检测阴性的患者中，P-Akt阳性者为2例（28.6%），HPV感染阳性患者的P-Akt阳性表达率也显著高于HPV感染阴性的患者，比较有统计学差异（P<0.05）。

3 讨论

宫颈癌具有高发病率和高死亡率的特点，对宫颈癌患者的早期诊断和及时治疗对于女性患者具有十分重要的意义。研究发现，超过95%的宫颈癌患者均有人乳头瘤病毒（HPV）感染的情况，而并非患者发生HPV病毒后就一定会发展成为宫颈癌，调查数据显示，发生HPV病毒感染的患者中，仅有一成左右在持续感染的情况下最终发展成为宫颈高危病变或者浸润性宫颈癌，因而HPV病毒感染诱发宫颈癌的机制也并不十分明确。另一方面，Akt因其在肿瘤组织中的高表达情况已被定义为癌基因，作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其位于磷脂酰肌醇-3-激酶（P13K）/Akt信号转导通路的枢纽部位，而磷脂酰肌醇3激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT）信号转导通路是可以参与细胞的生长、增殖与分化调节等的信号转导通路，在细胞中广泛存在，大部分的恶性肿瘤（如宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌等）都有P13K/AKT信号转导通路异常激活的情况，在这种情况下，肿瘤细胞受到刺激，发生恶性增殖、形成血管，并使得肿瘤细胞的侵袭或者转移能力增强。在正常的静止细胞中，Akt/PKB一般处于组织细胞的胞浆中，而浆膜属于活化部位，当其受到细胞因子、生长因子、激素等的刺激作用后，Akt催化结构域和调节结构域的两个位点相继磷酸化，进而活化，P-Akt就是Akt的活化形式，发生活化之后，其可以向胞液和胞核转位，并起到挥调控作用。

本文分别比较了宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、慢性宫颈炎三种不同宫颈病变患者的P-Akt表达阳性率，发现随着病变程度越来越严重，P-Akt表达阳性率也越高，宫颈癌患者的P-Akt表达阳性率达到97.1%，提示其与宫颈病变之间呈显著正相关，而对宫颈癌、宫颈上皮内瘤变患者的HPV感染阳性与P-Akt表达阳性之间的关系进行比较，也可见HPV感染阳性患者的P-Akt阳性表达率（90.0%）显著高于HPV感染阴性的患者（28.6%），二者也呈正相关，这与杜趁香等的研究结果一致，其还对宫颈癌患者的淋巴结转移情况与P-Akt表达阳性率进行了比较，发现发生淋巴结转移的患者，P-Akt表达阳性率可达100.0%。

有国外研究认为高危型人乳头瘤病毒HPV16的E5可以对P13K/Akt通路进行激活，同时其产生的E6蛋白能够与宿主细胞的抑癌基因P53结合并导致其降解，引起后者阻断DNA异常细胞周期性复制的功能受损，并导致细胞永生化诱发癌变；其产生的E7蛋白有能够与肿瘤抑制蛋白Rb（控制细胞周期起始相关蛋白）相互作用，引起细胞周期失控，导致永生化的发生。结合本文及相关国内外研究的结果，均可以推测宫颈癌的发生，可能与P-Akt的激活有关，据此可以为宫颈癌的诊断治疗提供新的研究方向。

（收稿日期：2015-05-06）endprint