舌鰕虎鱼的人工繁殖及其胚胎发育

严银龙，施永海，邓平平，张忠华，张海明，赵峰

（1.中国科学院东海水产研究所农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海200090；2.上海市水产研究所上海市水产技术推广站，上海200433）

舌鰕虎鱼的人工繁殖及其胚胎发育

严银龙1、2，施永海2，邓平平2，张忠华2，张海明2，赵峰1

（1.中国科学院东海水产研究所农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海200090；2.上海市水产研究所上海市水产技术推广站，上海200433）

为掌握舌鰕虎鱼Glossogobius giuris的人工繁殖技术及其胚胎发育特点，进行了舌鰕虎鱼人工繁殖试验和胚胎发育观察，研究了舌鰕虎鱼亲鱼强化培育、人工催产、产卵受精和胚胎发育过程，并描述了胚胎各发育时期的时序和形态特征。结果表明：性腺成熟的舌鰕虎鱼亲鱼经两次激素注射催熟催产，催产率为60%～80%，受精率为73.4%～81.2%，孵化率为63.8%～77.2%；舌鰕虎鱼受精卵为纺锤形，呈黏性且半透明；胚胎发育分为胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和出膜期7个阶段，以及26个发育时期；在25～27℃条件下需要108 h完成孵化过程，初孵仔鱼体长为2.5～3.5 mm，全长为2.7～3.8 mm，肌节为26～28对，心跳为50～55次/min。本研究结果可为舌鰕虎鱼资源的保护和人工繁殖提供理论指导。

舌鰕虎鱼；人工繁殖；催产；胚胎发育

舌鰕虎鱼 Glossogobius giuris隶属于鲈形目Pecrformes、鰕虎鱼亚目Gobioidei、鰕虎鱼科Gobiidae、鰕虎鱼属Glossogpbius，属于近海底层小型肉食性经济鱼类，常活动于底质为淤泥或泥沙的海域，多穴居。舌鰕虎鱼习性较为凶猛，主要摄食幼鱼、虾米和小型软体动物，其味道鲜美、肉质鲜嫩、营养丰富，具有较高的经济价值。2龄舌鰕虎鱼性成熟后，每年4～8月为产卵期，卵呈黏性，常黏附于石块和岩礁上。

目前，国内外对舌鰕虎鱼的研究非常有限，仅见对其生长［1］和肌肉营养成分［2］方面的有关报道。当前舌鰕虎鱼市场的需求主要依赖于野生资源的捕捞，易造成资源种群结构的破坏，因此，需要探索研究舌鰕虎鱼的人工繁殖和规模化养殖，为人工增养殖和资源保护性放流提供保证。国内外对鱼类的胚胎发育研究已很成熟，如对大银鱼［3］、翘嘴鳜［4］、斑鳜［4］和太湖翘嘴红鲌［5］等的胚胎发育研究已见报道。本研究中，进行舌鰕虎鱼的人工繁殖试验和胚胎发育观察，旨在为今后开展其苗种的规模化培育生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料

试验用舌鰕虎鱼亲鱼由上海市水产研究所苗种技术中心提供，于2012年从近海水域采捕获得。此后每逢繁育季节挑选体表无擦伤的性腺成熟个体，平均体质量为30～50 g，平均体长为15～20 cm，培育8～10个月后作为储备亲鱼。

1.2方法

1.2.1亲鱼的培育及挑选 亲鱼培育在室内20 m3水泥池 （长×宽×深为6.5 m×2.5 m×1.3 m）中进行，池底铺设洞穴之类的沉性塑料灰管，布放密度为3～5个/m2。培育池水深为1.1～1.2 m，盐度为10～15，水温为10～30℃，放养密度为5～10尾/m2。每天投喂鲜活或冰冻小鱼小虾，日投喂量为鱼体质量的2% ～10%，并合理搭配鳗鱼饲料，日投喂量为鱼体质量的1%～2%。每天吸污1次，根据摄食情况对投饵量进行灵活调整。每周换水1次，换水量为原水体的70% ～80%，每次换水时，温差≤±1.0℃，盐度差≤±1.0，每月倒池1次。当水温超过22℃时，从暂养的亲鱼中挑选体表光滑、无伤痕、体格健壮、活力好、性腺发育良好的舌鰕虎鱼进行产前强化培育。

1.2.2人工催产和授精 当水温达到24～25℃时，定期观察亲鱼的性腺发育程度，选择合适时机，用绒毛膜促性腺激素 （HCG）和促黄体释放激素 （LHRH-A2）进行催熟催产，促使亲鱼性腺成熟，以便集中产卵授精。试验时，采用两次注射激素催熟催产法，第一次注射HCG和LHRH-A2的混合液，雌鱼注射的激素混合液剂量分别为500～1000 IU/kg（体质量）HCG、1～2 μg/kg（体质量）LHRH-A2，在第一次注射激素48 h后再注射LHRH-A2激素，剂量为5～10 μg/kg（体质量），一般效应期在36～48 h后便可挤出发育较为成熟的卵子。雄鱼激素的使用剂量减半。产卵池内放养舌鰕虎鱼亲鱼雌、雄比为1∶1.5～2.0，密度为5～10尾/m2。池底铺设舌鰕虎鱼专用产卵巢，产卵巢为直径8～10 cm的灰色沉性塑料管，内衬40～60目网片。定时检查产卵巢，观察舌鰕虎鱼的产卵情况。

1.2.3受精卵孵化及胚胎发育观察 将产卵巢中6月27日催产、6月29日产卵的受精卵及时移入准备好的孵化池中单独孵化，水温为25～27℃，溶氧在5 mg/L以上。定时从产卵巢的网片上剥离受精卵，选取优质完整的受精卵，在 Olympus CX41显微镜下观察舌鰕虎鱼胚胎发育的过程。根据胚胎发育的不同阶段和预试验情况合理安排取样时间，受精卵至卵裂期每15 min取样1次；囊胚期至胚体形成期每30 min取样1次；肌节出现期至出膜期每1 h取样1次。用Olympus CX41显微镜进行胚胎发育的连续观测、测量，详细记录胚胎发育时间及其相应的主要形态特征［6-7］，并拍摄各个发育时期的照片，最后使用Photoshop软件对拍摄图片进行编辑。

2 结果与分析

2.1催产和孵化

舌鰕虎鱼经过越冬强化培育，挑选卵巢轮廓明显、下腹部比较柔软的雌鱼亲鱼和轻压腹部会有乳白色精液流出的雄鱼亲鱼进行人工催产。2014—2015年共进行了5批次舌鰕虎鱼亲鱼催产试验。在23.9～26.6℃水温条件下，经过36～48 h的效应期，共产卵62.5万粒，催产率为60%～80%，平均催产率为68%；受精率为73.4% ～81.2%，平均受精率为77.3%；孵化率为63.8%～77.2%，平均孵化率为71.0%；平均每尾雌鱼产卵1.84万粒 （表1）。

2.2胚胎发育

舌鰕虎鱼胚胎发育的分期和各期的时序见表2。从表2可知，在水温为25～27℃条件下，从受精卵到孵化出膜共108 h，其中胚盘期为1 h，卵裂阶段为2 h 18 min，囊胚阶段为55 min，原肠阶段为5 h，神经胚阶段为45 min，器官形成阶段为12 h 50 min。

表1　舌鰕虎鱼全人工繁殖情况Tab.1 Data of artificial propagation in forktongue goby Glossogobius giuris

2.2.1胚盘形成阶段 多个受精卵集聚呈指状型，前端粗后端细，胚盘在外鞘膜内前端，卵膜基部黏附于网片上，末端游离 （图1）。成熟卵呈纺锤形（图2-A），外鞘膜透明，具有一定的黏性，卵中含有数量较多且大小不等的油球。卵粒遇水后迅速吸水膨胀，产生弱黏性，便于卵子互相黏聚成卵块以及黏着于其他物体上。膨胀后外鞘膜长度为2.3～2.6 mm，宽为0.30～0.35 mm。鱼卵受精后1 h，原生质不断向动物极集中，最终动物极形成半透明的胚盘 （图2-B）。吸水后受精卵胚盘直径为0.4～0.5 mm。

2.2.2卵裂阶段 鱼卵受精后1 h 20 min，胚盘出现第1次经裂 （图2-C），形成2个大小相似的细胞，进入2细胞期；受精后1 h 37 min，进行与第1次卵裂相垂直的2次卵裂，形成4个大小形态相似的卵裂细胞，进入4细胞期 （图2-D）；自此卵裂细胞呈几何数增加，在原有的基础上相继发育至8细胞 （图2-E）、16细胞期 （图2-F）、32细胞期 （图2-G）、64细胞期 （图2-H）；受精后5 h 05 min，卵裂细胞越来越小，堆积成多细胞体，犹如桑椹状，进入桑椹期 （图2-I）。

图1　舌鰕虎鱼受精卵Fig.1 Fertilized egg of forktongue goby Glossogobius giuris

表2　舌鰕虎鱼胚胎发育时序Tab.2 Temporal sequence of embryonic development of forktongue goby Glossogobius giuris

2.2.3囊胚阶段 随着分裂的继续推进，鱼卵受精后5 h 20 min进入囊胚期，卵裂细胞小且界限模糊，在显微镜下只能区分边缘部位的卵裂细胞，卵裂细胞高耸于动物极，随着胚盘细胞的进一步分裂，胚盘逐渐变矮。根据胚盘的高度，舌鰕虎鱼囊胚期可分为高囊胚 （图2-J）与低囊胚 （图2-K）发育时期。

图2　舌鰕虎鱼的胚胎发育Fig.2 Embryonic development of forktongue goby Glossogobius giuris

2.2.4原肠期阶段 鱼卵受精后8 h进入原肠期，胚盘在囊胚阶段逐渐变矮的过程中过渡到原肠胚阶段逐渐下包。在胚盘分裂并逐渐下包至卵黄体1/3时，动物极边缘增厚形成帽状胚环，进入原肠早期（图2-L）；当胚盘下包卵黄体的1/2时侧面观察可见胚盾，此时为原肠中期；当胚盘下包卵黄体的3/4时，胚盾延长，进入原肠晚期 （图2-M）。

2.2.5神经胚阶段 鱼卵受精后14 h 05 min，当胚盘下包至卵黄体的4/5～6/7时，进入神经胚期（图2-N），胚盘顶部逐渐膨大隆起，脑泡开始分化，神经板形成；受精后14 h 26 min，胚体继续下包直至胚孔封闭 （图2-O），从而到达胚体形成期（图2-P）。

2.2.6器官形成阶段 鱼卵受精后15 h 10 min，胚体中部开始出现1～3对肌节 （图2-Q），受精后16 h，脑泡两侧出现眼囊 （图2-R），随后眼囊变圆，眼晶体形成 （图2-S）；受精后23 h，胚体包卵黄约1/2，尾泡形成并开始与卵黄分离，出现8～10对肌节，进入尾芽期 （图2-T）；受精后28 h，胚体间歇性抽动，肌节为20～22对且开始变窄，进入肌肉效应期 （图2-U）；受精后33 h，耳石出现，心脏跳动，平均心搏频率为50～55 次/min，肌节为26～28对，进入心跳期 （图2-V）。出膜前期胚体在膜内抽动力度加大、频次加快，但膜体积相对胚体较大，在膜内留存时间较长。

2.2.7出膜阶段 鱼卵受精后108 h进入出膜期，出膜之前胚体运动明显加快、加强，运动方式有翻转、旋转，然后卵膜变软，由胚体尾部或头部首先破膜，再翻转、旋转，使膜的破口变大，最后胚体弹出。初孵仔鱼体长为 2.5～3.5 mm，全长为2.7～3.8 mm，肌节为26～28对，心跳为50～55 次/min。

3 讨论

3.1舌鰕虎鱼的人工繁殖

舌鰕虎鱼属于底栖鱼类，喜欢穴居，2龄时成熟，自然繁殖期为每年的4～8月。本试验中观察发现，繁殖季节同龄雌鱼卵巢比雄鱼精巢先发育成熟，雄鱼进入产卵巢中等待雌鱼，雌鱼分批产卵后，雄鱼再产出精子进行受精，雄鱼继续在产卵巢中守巢护卵。产卵雌鱼受到惊吓后可能会将卵零散地产于池壁上。舌鰕虎鱼产卵一般在清晨进行，很少在下午或者午夜。试验过程中也会偶尔发现，整片产卵巢黏附的卵皆未受精而霉变。舌鰕虎鱼有守巢护卵习性、雌雄性腺发育不同步性，以及全人工繁殖时需解剖雄鱼等方面特点，与纹缟鰕虎鱼Tridentiger trigonocephalus［8］、斑尾刺鰕虎鱼 Acanthogobius ommaturus［9］、沙鳢Odontobutis obscura［10］较相似。

3.2舌鰕虎鱼的胚胎发育

舌鰕虎鱼受精卵呈纺锤形、微黄色、半透明，有较强黏性，具有大小不等的数个油球。受精后卵膜吸水膨胀［11-12］，卵膜末端有黏丝，能黏附在巢壁 （网片、岩石或其他硬物）上，这与子陵栉鰕虎鱼Ctenogobiusgiurinus［13］、波氏 吻 鰕虎 鱼C.cliffordpopei［14］、粘皮鲻鰕虎鱼Mugilogobius myxodermus［15］、沙鳢［10］相同。由于卵膜为纺锤形，胚胎在卵膜中纵向发育的空间相对圆形卵更大，在水温接近的条件下，其胚胎在孵化中需要比圆形卵更多的生长时间才能出膜。鞍带石斑鱼受精卵在水温为 （27±0.5）℃的条件下，从心跳期至出膜期需历时 3 h 53 min［16］；长江刀鲚受精卵在水温为（23.64±0.36）℃的条件下，从心跳期至出膜期需历时2 h 55 min［17］；南方鮸鱼受精卵在水温为24.5～24.7℃的条件下，从心跳期至出膜期需历时4 h 58 min［18］；斜带石斑鱼受精卵在水温为（25±0.5）℃的条件下，从心跳期至出膜期需历时4 h 05 min［19］。相比较而言，相同卵形结构的子陵栉鰕虎鱼在水温为23～25.2℃的条件下，从心跳期至出膜期需历时56 h 38 min［13］，而本试验中舌鰕虎鱼受精卵在水温为25～27℃的条件下，从心跳期至出膜期需历时75 h。

由于受精卵外鞘长与宽之比约为8∶1，且受精卵中含有较多大小不一的油球，对胚体发育的拍摄观察形成了一定的障碍，特别对卵裂期的拍摄与观察影响更为明显。一方面易混淆视线，另一方面对受精卵只能从侧面拍摄，而不能从胚盘的背面进行更为细致的观察，这与对子陵栉鰕虎鱼［13］、波氏吻鰕虎鱼［14］、粘皮鲻鰕虎鱼［15］研究时所采用的方法相同。

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Artificial propagation and embryonic development of forktonge goby Glossogobius giuris

YAN Yin-long1，2，SHI Yong-hai2，DENG Ping-ping2，ZHANG Zhong-hua2，ZHANG Hai-ming2，ZHAO Feng1

（1.Key Laboratory of East China Sea&Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.Shanghai Fisheries Technical Extension Station，Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai 200433，China）

The brood stock rearing，artificial spawning，fertilization and embryonic development of forktonge goby Glossogobius giuris were studied to develop artificial breeding techniques of forktonge goby.The development time and morphological characteristics of each embryonic development stage were described.The ripe forktonge goby were induced to spawn by twice injections of hormone，with spawning success of 60%-80%，fertilization rate of 73.4%-81.2%and hatching rate of 63.8%-77.2%.The fertilized eggs were translucent，adhensive and fusiform in shape，and the embryonic development was divided into 7 physiological stages includding fertilized egg stage，cleavage stage，blastula stage，gastrula stage，neural stage，organogenesis stage and hatching stage with 26 substages.The fertilized eggs were hatched in 108 hours at 25-27℃.Newly hatehed larvae had average body length of 2.5-3.5 mm，total length of 2.7-3.8 mm with about 26-28 myomeres and heart beating rate of 50-55 times per minute.The findings might provide theoretical guidance for protection of resources and artificial breeding of forktonge goby.

Glossogobius giuris；artificial propagation；induced spawning；embryonic development

S961.2

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.005

2095-1388（2016）01-0024-06

2015-09-24

农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室开放课题 （2014K06）；上海长江口主要经济水生动物人工繁育工程技术研究中心 （13DZ2251800）

严银龙 （1964—），男，高级工程师。E-mail：yinlongyan@163.com

施永海 （1975—），男，教授级高级工程师，硕士生导师。E-mail：yonghais@163.com