砂烫生附片与炮附片制备前后6种生物碱的变化

陈 炯， 谭 鹏， 吴月娇， 秦语欣， 王 蕾， 李 飞（北京中医药大学，北京100102）



砂烫生附片与炮附片制备前后6种生物碱的变化

陈 炯， 谭 鹏， 吴月娇， 秦语欣， 王 蕾， 李 飞*
（北京中医药大学，北京100102）

目的 研究砂烫生附片代替炮附片 （砂烫黑顺片）的可能性。方法 泥附子切片制成生附片后砂烫，并观察其外观性状。HPLC法测定单酯型 （苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱）和双酯型 （新乌头碱、乌头碱、次乌头碱）生物碱总含有量。结果 两种炮制品外观性状均无明显差异。砂烫生附片制备前双酯型生物碱总含有量为0.067 5%，制备后降为0.001 5%；炮附片制备前后均检测不到。砂烫生附片制备前单酯型生物碱总含有量为0.014 1%，制备后增至0.038 2%；炮附片制备前为0.019 5%，制备后降为0.011 4%。两者均符合 《中国药典》要求 （双酯型生物碱总含有量不得超过0.020%）。结论 砂烫生附片 （仲景制法）具有低毒高效的特点，值得深入研究。

生附片；炮附片；砂烫；生物碱；HPLC

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功能［1］，其为有毒中药，一般炮制后使用［2］。张仲景所著 《伤寒论》中附子的炮制要求为 “炮，去皮脐，破八片”，有人考证后认为，“炮”是将中药包裹后在火中烧［3-7］，而 《中国药典》2010年版 （以下简称药典）收载的炮附片（砂烫黑顺片）制备方法为砂烫。本实验对张仲景使用附子的脚注进行分析，认为其炮制对象为生附子，“炮”法的实质是干热，包裹后加热是为了炮制过程中中药受热更为均匀，故采用药典炮附片的炮制方法，以河砂代替包裹物作为中间传热体，制备砂烫生附片，并与炮附片从外观性状、3种双酯型 （新乌头碱、乌头碱、次乌头碱）和3种单酯型 （苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱）生物碱含有量进行比较研究，分析其科学价值。

1　材料与试剂

1.1仪器 CGQ-750Z型自控温鼓式炒药机；DFT-100型粉碎机 （温岭市林大机械有限公司）；Agi1ent1100高效液相色谱仪，包括DAD检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵（美国Agi1ent公司）；SB25-12DTDN型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-3型循环多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪 （上海振捷实验设备有限公司）。

1.2材料 黑顺片、生附片购自四川江油中坝附子科技发展有限公司，经中国食品药品检定研究院张继主任药师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品。

乌头碱 （批号 110720-201111）、新乌头碱（批号110798-201106）、次乌头碱 （批号110799-201106）、苯甲酰乌头原碱（批号 111794-201102）、苯甲酰新乌头原碱 （批号 111795-201002）、苯甲酰次乌头原碱 （批号 111796-201002）对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、四氢呋喃为色谱纯 （德国Merck公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯净水 （杭州娃哈哈集团有限公司）。

2　炮制品制备

2.1砂烫生附片 取洁净河砂20 kg，置于炒药机内，温度升至200℃，投入生附片2 kg，不断转动，炒制7 min至表面呈黄棕色时取出，筛去河砂，晾凉，平行制备3批，粉碎备用。

2.2炮附片 （砂烫黑顺片） 投入黑顺片2 kg，其他操作同 “2.1”项。

3　方法与结果

3.1外观性状观察 生附片表面黄白色，断面黄白色，质脆；砂烫生附片表面黄棕色，断面黄色，质脆。黑顺片表面、断面暗黄色，质硬而脆；炮附片表面颜色、断面颜色、质地与砂烫生附片基本一致。具体见图1～2。

3.2生物碱含有量的测定［1］

3.2.1色谱条件 Agi1ent Extend C18色谱柱（4.8 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈-四氢呋喃（25∶15，A）-0.1 mo1/L醋酸铵溶液（每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL，B），梯度洗脱 （0～8 min，15%～26%A；48～49 min，26%～35% A；49～58 min，35%A；58～65 min，35%～15%A）；检测波长235 nm；柱温25℃；体积流量1.0 mL/min。

3.2.2对照品溶液的制备 精密称取对照品适量，置于10 m L量瓶中，加入异丙醇-二氯甲烷 （1∶1）混合溶液溶解，并稀释至刻度，即得含新乌头碱0.055 mg/mL、乌头碱0.045 mg/mL、次乌头碱0.012 mg/mL、苯甲酰新乌头原碱0.082 mg/mL、苯甲酰乌头原碱0.022 mg/mL、苯甲酰次乌头原碱0.097 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

3.2.3供试品溶液的制备 分别精密称取各样品粉末 （过3号筛）2 g，置于具塞锥形瓶中，加入氨试液 3 mL，再精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 m L，称定质量，超声处理（300 W、40 kHz、25℃以下）30 min，放冷，异丙醇-乙酸乙酯 （1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，过0.45μm微孔滤膜，即得。

3.2.4精密度、稳定性、重复性试验 由于本实验的含有量测定方法参考药典［1］，而药典均已经过方法学考察，故未进行相关试验。

图1　生附片及其炮制品外观性状Fig.1 Appearance characters of Shengfupian and its processed p roducts

图2　黑顺片及其炮制品外观性状Fig.2 Appearance characters of Heishunpian and its processed products

3.2.5加样回收率试验 精密称取含有量已知的同一砂烫生附片样品9份，每份2 g，按样品中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱含有量的80%、100%、120%加入对照品溶液，按 “3.2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “3.2.1”项色谱条件下进样10μL。结果见表1。

表1　加样回收率试验结果（n=3）Tab.1 Results of recovery tests（n=3）

3.2.6含有量测定 分别精密吸取对照品和供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，外标法计算各供试品中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含有量。每批样品平行测定2份，每份平行2次。结果见表2。

4　讨论

附子炮制的目的是减毒，其机制为剧毒型乌头类双酯型生物碱在加热过程中，C8位上的乙酰基水解或分解，失去一分子醋酸，得到相应的苯甲酰单酯型生物碱，其毒性仅为双酯型乌头碱的1/50～1/100。再进一步将C14位上的苯甲酰水解或分解，失去一分子苯甲酸，得到亲水性氨基醇型类乌头原碱，其毒性仅为双酯型乌头碱的1/2 000～1/4 000［8-10］。

黑顺片砂烫后，双酯型生物碱检测不到，而生附片砂烫后其总含有量由 0.067 5%降至0.001 5%，表明砂烫生附片与炮附片 （砂烫黑顺片）均符合药典规定 （双酯型生物碱总含有量不得超过0.020%）。黑顺片砂烫后，单酯型生物碱总含有量降低率为42%；生附片砂烫后，双酯型生物碱总含有量降低约98%，单酯型生物碱总含有量增加约3倍，表明砂烫可以促使生附片中双酯型生物碱向单酯型转化，达到减毒的效果。黑顺片在产地加工时，需经过胆巴浸泡、煮、浸漂、蒸等过程，双酯型生物碱向单酯型转化的一级水解过程已完成，在砂烫时，可能促使其水解或分解，导致含有量进一步降低。

表2　含有量测定结果（%，n=2）Tab.2 Results of content determ ination（%，n=2）

附子于6月下旬至8月上旬采挖，除去母根、须根及泥沙，习称 “泥附子”。因附子在夏至季节采收后极易腐烂，故须进行产地加工 （胆巴水浸泡）以防腐［11］。药典法制备附子饮片 （包括黑顺片）时，均有 “泥附子洗净，浸入食用胆巴的水溶液中数日［1］”的产地加工程序。研究表明，附子在胆巴溶液中浸泡20 d后能达到防腐的效果，但胆巴含有量 （以氯化钙计）达25%～30%［12］，双酯型和单酯型生物碱均流失70%左右［13］。为保证临床用药的安全性和有效性，建议改进泥附子产地加工方法，省去胆巴浸泡和浸漂的炮制工序。砂烫生附片中主要药效成分单酯型生物碱的含有量较炮附片高约4倍，而且未经胆巴处理，无浸漂过程，可避免胆巴残留和生物碱成分流失，缩短炮制时间，节约成本。后期药理实验研究结果表明，砂烫生附片无明显毒性，具有抗炎镇痛、抗心衰的作用，故砂烫生附片 （仲景制法）具有低毒高效的特点，在炮制工艺及成分含有量上均优于炮附片，值得深入挖掘与研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：177-178.

［2］陈荣昌，孙桂波，张 强，等.附子炮制减毒的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（15）：237-241.

［3］王 宁，张惠伟.论附子的炮制［J］.中成药，1990，12（2）：15-16.

［4］朱日然，李启艳，朱宗敏，等.HPLC法测定附子与其炮制品中双酯型生物碱［J］.中成药，2011，33（8）：1375-1378.

［5］旷惠桃，潘远根.仲景药物炮制中火制法考疑［J］.湖南中医学院学报，1995，15（3）：4-5.

［6］杨 栋，孙 庆.浅谈伤寒论中附子的生用与熟用［J］.中成药，2000，22（8）：67-68.

［7］国 伟，谭 鹏，吴月娇，等.双辅料炮制对盐附子传统性状和酯型生物碱的影响［J］.中成药，2015，37（6）：1289-1293.

［8］龚千峰.中药炮制学［M］.2版.北京：中国中医药出版社，2007：294-297.

［9］秦语欣，谭 鹏，国 伟，等.米醋对制川乌生物碱的影响［J］.中成药，2015，37（4）：828-831.

［10］徐姗珺，陈长勋，高建平.甘草与附子配伍减毒的有效成分及作用环节研究［J］.中成药，2006，28（4）：526-530.

［11］黄勤挽，周子渝，王 瑾，等.附子炮制历史沿革研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（23）：269-271.

［12］周 林，李 飞，任玉珍，等.附子中生物碱含量随在胆巴液浸泡时间变化规律的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（10）：78-81.

［13］周 林，李 飞，任玉珍，等.附子中胆巴含量随浸泡时间的变化趋势研究［J］.中华中医药学刊，2013，31（11）：2406-2408.

Variations of six alkaloids in Shengfupian heated with sand and Paofupian before and after preparation

CHEN Jiong， TAN Peng， WU Yue-jiao， QIN Yu-xin， WANG Lei， LIFei*

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

AIM To study the possibi1ity of Shengfupian heated with sand substituted for Paofupian（Heishunpian heated with sand）.METHODS Nifuzi was s1iced and processed to Shengfupian，which was then heated with sand，and the appearance characters were observed.The tota1 contents of monoester-type（benzoy1mesaconine，benzoy1aconitine and benzoy1hypacoitine）and diester-type（mesaconitine，aconitine and hypaconitine）a1ka-1oidswere determined by HPLC.RESULTS The appearance characters of these two processed products showed no significant difference.The tota1content of diester-type a1ka1oids in Shengfupian was 0.067 5%before preparation，and decreased to 0.001 5%after preparation，whi1e that in Paofupian was not detected before and after preparation.The tota1 content ofmonoester-type a1ka1oids in Shengfupian was 0.014 1%before preparation，and increased to 0.038 2%after preparation，whi1e that in Heishunpian was 0.019 5%before preparation，and decreased to 0.011 4%after preparation.Both of them meet Chinese Pharmacopeia requirement（the tota1content of diester-type a1ka1oids shou1d not be more than 0.020%）.CONCLUSION Shengfupian heated with sand（Zhongjingmethod）has the characteristics of 1ow toxicity and high efficacy，which isworthing further study.

Shengfupian；Paofupian；heated with sand；a1ka1oids；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1342-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.028

2015-10-04

中医药行业科研专项 （201107008）；北京中医药大学在读研究生项目 （2015-JYB-XS094）

陈 炯（1990—），女，硕士生，研究方向为中药炮制。E-mai1：chenjiong886@163.com

李 飞（1964—），女，硕士，教授，研究方向为中药炮制。E-mai1：1f668@sina.com