中草药对产后子宫内膜炎病猪分离菌体外抑菌试验

葛 凯左瑞华周梦雪　董雅婷张雅廷程楠楠

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽六安　237012；2.皖西学院健康养殖与动物疫病监测预警工程技术中心，安徽六安　237012）

中草药对产后子宫内膜炎病猪分离菌体外抑菌试验

葛 凯1，2左瑞华1，2周梦雪1董雅婷1张雅廷1程楠楠1

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽六安237012；2.皖西学院健康养殖与动物疫病监测预警工程技术中心，安徽六安237012）

选择患有产后子宫内膜炎的母猪，采集子宫分泌物，分离出两种菌株：大肠杆菌和链球菌。选择五味子等15种中草药，应用水提醇沉法制成质量浓度为1g/mL中草药提取液，分别应用牛津杯法进行体外抑菌试验；采用试管两倍稀释法测定了中草药的最小抑菌浓度。结果显示，15种中草药中，五味子提取物对两种细菌的抑菌效果较好，其强度均在中等以上，其余的中草药抑菌效果不明显；五味子对链球菌的最小抑菌浓度是15.65mg/m，对大肠杆菌是7.8mg/ml。通过此项研究，对中草药五味子的开发利用研究提供参考。

猪；产后子宫内膜炎；大肠杆菌；链球菌；五味子

1 材料与方法

1.1病料采集和细菌分离

对某养猪场患有产后子宫内膜炎病猪应用输精管采集子宫分泌物，注入灭菌的离心管中，4℃保存备用。

用接种环蘸取备用的病料，均匀划线涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃恒温培养24h。仔细观察菌落，挑选数量较多、形态一致的菌落，转接到另外一个培养基上，继续37℃恒温培养24h，即得到纯化的菌种，取纯化的单一菌落涂片，经革兰氏染色鉴定方法，进行细菌初步鉴定。

1.2中草药提取物

根据文献资料，选择15种中草药：五味子、黄柏、金银花、柴胡、蒲公英、大黄、连翘、苦参、黄苓、红花、益母草、鱼腥草、铁皮石斛、丹参、大青叶，均购自中药材市场。

应用水提醇沉法工艺制备中草药提取液，取中草药各100g，放在干净的大烧杯中，加适量体积水浸泡24h，放在可调电炉上大火蒸煮，煮沸后，改为小火慢熬2h后，待冷却后用干净的双层纱布过滤，收集滤液。将药渣再次按前述方法制备滤液，将2次滤液合并，将滤液减压浓缩至所需体积，按1：4的体积比加入无水乙醇，常温静置12h，真空抽滤去除沉淀，滤液经旋转蒸发器减压浓缩成100mL，获得质量浓度为1g/mL的中草药提取液，4℃保存备用。

1.3中草药提取物体外抑菌试验

设置2个西药对照组：环丙沙星和头孢曲松；15个中草药组：五味子、黄柏、金银花、柴胡、蒲公英、大黄、连翘、苦参、黄苓、红花、益母草、鱼腥草、铁皮石斛、丹参、大青叶。

西药组用药敏纸片法进行抑菌试验；中草药组用牛津杯法：将纯化的菌种均匀涂在牛肉膏蛋白胨培养基中。然后将培养基在底部划分几个均匀间隔区域并标记，将牛津杯按区域放置（注意牛津杯放置时要轻轻地按压一下，防止药液渗出），再分别注入先前准备好的中药提取液均为200μl。最后，与西药组共同置放在37℃恒温培养24h，培养后用游标卡尺测量抑菌圈直径。此项试验每种药物设3个重复，取3次试验的平均值。

抑菌效果判定标准：根据抑菌圈直径大小判定如下：

抑菌圈：>20mm，记为：++++，抑菌效果：强；

抑菌圈：15-20mm，记为：+++，抑菌效果：较强；

抑菌圈：10-15mm，记为：++，抑菌效果：中；

抑菌圈：5-10mm，记为：+，抑菌效果：差；

抑菌圈：＜5mm，记为：-，抑菌效果：无效。

1.4中草药提取物最小抑菌浓度（MIC）的测定

1.4.1菌液的制备

将分离纯化的病菌，接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃恒温培养24h。挑取单一菌落，再接种于1%葡萄糖肉汤培养基中，37℃恒温培养24h。用高压灭菌生理盐水进行稀释，制成含菌落数量为105～106个/ml的菌悬液。

1.4.2最小抑菌浓度（MIC）的测定步骤

采用试管两倍稀释法测定MIC值，取10支大小一致试管顺序编号：1～10号。每管均装入5ml肉汤液体培养基，1号管中加入中草药提取液5mL，涡旋混匀后吸取5ml转移至2号管，以此类推，至8号管吸取5ml弃去，9号管为阳性对照，10号管为阴性对照。1～8号管的中草药提取液浓度分别为500，250，125，62.5，31.25，15.65，7.8，3.9mg/ml，然后于1～8号管中分别接入菌悬液20μl，37℃恒温培养24h。转接到牛肉膏蛋白胨培养基上继续培养，37℃，24h。最后观察，无细菌生长的最小中药浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。

1.5数据分析

应用SPSS19.0分析软件对中草药的抑菌效果进行方差分析，然后对均值进行多重比较，结果采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1产后子宫内膜炎病猪分离菌

本次试验中，分离出多种细菌，其中菌落数量较多，最具优势的菌种是链球菌和大肠杆菌，因此选用这两种菌作为本次试验菌。有的学者对从患有子宫内膜炎病猪体内分离获得主要致病菌有葡萄球菌、绿脓杆菌等［7］，本次实验没有分离到绿脓杆菌，葡萄球菌很少。

2.2中草药提取物的抑菌效果

15种中草药提取液分别做了抑菌试验，研究结果发现，五味子的抑菌效果非常明显，与西药效果相当。其它14种中草药抑菌效果不明显或者没有效果，此处不再列出。见表1 、表2。

水提醇沉法制备工艺获得中草药提取物是一种混合物，五味子的有效成分可能适合这种提取方法，而有的中草药可能没有提出有效成分。随着现代中药制剂工艺发展，有学者采用醇提或有机溶剂萃取法，得到更加单一的成分，有利于中药制剂的开发应用。同一种中草药对不同细菌抑制效果也不一致，已有不少学者做了大量的研究报道，本试验中五味子对两种细菌的抑制效果不完全一样，也表现出这个特点。

表1　五味子对链球菌的抑制效果

表2　五味子对大肠杆菌的抑制效果

2.3五味子最小抑菌浓度（MIC）

抑菌效果不明显的中草药提取液此项试验省略。五味子对两种分离菌的MIC值测定结果如表3所示。链球菌是15.65mg/ml，大肠杆菌是7.8mg/ml，五味子体外抑制大肠杆菌的强度明显大于链球菌。此项试验发现所分离的细菌种类不同，所需要的五味子最小抑菌浓度也是不一样。有学者对五味子的有效抑菌浓度做了各方面的研究，五味子提取物对链球菌和大肠杆菌的MIC值有一定的差别，这与本实验结果较一致。

五味子因富含多糖等多种化学成分，具有保肝益肾等功能，近年来成研究热点，五味子的提取物能够有效抑制猪源大肠杆菌和链球菌的生长，可能与五味子中具有多种抗菌成分有关。

表3　五味子抑制病原菌MlC值

3 小结

本项研究从众多的中草药中，发现五味子提取物能有效抑制产后子宫内膜炎病猪的主要分离菌：大肠杆菌和链球菌，而且抑制效果与抗生素相当。五味子的最小抑菌浓度分别是：链球菌是15.65mg/ml，大肠杆菌是7.8mg/ml。为了进一步弄清楚五味子的抗菌活性成分，下一步将对五味子主要有效成分进行分离提纯并详细分析鉴定，为中草药制剂的精制和开发应用提供参考。

［1］叶健毅，赵学峰，陶家树，等.母猪子宫内膜炎致病菌药敏试验及临床治疗［J］.动物医学进展，2010，31（12）：172-176.

［2］李淑红，王京仁，成钢，等.8种中草药对猪大肠杆菌的体外抑菌试验［J］.广东农业科学，2012，（22）：131 -135.

［3］张霞，艾启俊，孙宝忠，等.中草药提取物对沙门氏菌的抑菌效果研究［J］.食品工业科技，2010，（1）：88-90.

皖西学院动物科学专业校企合作实践教学基地项目（2016WXXY30）。

葛凯（1977—），男，安徽寿县人，硕士，讲师，研究方向：中兽医药的研究与教学。