骨髓细胞形态学联合细胞化学染色检测在神经母细胞瘤诊断中的应用

单莹，高丹，刘勇，卢丽萍，秦晓松，郑锐

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004)



骨髓细胞形态学联合细胞化学染色检测在神经母细胞瘤诊断中的应用

单莹，高丹，刘勇，卢丽萍，秦晓松，郑锐

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004)

目的探讨骨髓细胞形态学联合细胞化学染色检测在神经母细胞瘤(NB)诊断中的应用。方法 NB患儿33例(病例组)，F3抗体阳性。对照组选自同期住院的患儿20例，F3抗体阴性。对两组进行常规的骨髓细胞形态学显微镜镜检和细胞化学染色[过氧化物酶(POX)﹑碱性磷酸酶(NAP)﹑糖原(PAS)染色)]，并对其诊断效能进行分析。结果两组NAP、POX、PAS染色阳性率比较，P均<0.01。显微镜下发现紫红色的条索状纤维样物质和瘤细胞呈菊花团排列是诊断和鉴别诊断NB方法之一。骨髓细胞形态学观察联合PAS染色诊断NB的灵敏度及特异度均高于单独细胞形态学观察及PAS染色(P均<0.01)。结论 在形态学中发现紫红色的条索状纤维样物质和瘤细胞呈菊花团排列是诊断和鉴别诊断NB方法之一。骨髓细胞形态学联合细胞化学染色(PAS)可提高NB的诊断率。

神经母细胞瘤；细胞形态；细胞化学染色；诊断

神经母细胞瘤(NB)是最常见的儿童恶性实体肿瘤之一，病死率高[1]，其发病率呈逐年升高趋势[2]。NB在新生儿期即可发病，早期便发生转移[3]，严重威胁儿童生命，其转移部位为骨、淋巴结、骨髓、眼眶和皮肤等[4]，且与原发灶大小无关。发病隐匿，早期诊断比较困难。发生骨髓转移时，转移至骨髓内的瘤细胞在形态上与原幼淋巴细胞和粒细胞很难区别，骨髓细胞学检查发现不同原发灶的骨髓转移形态特点不同，共同特点是涂片及边缘可见数量不等，散在的成团、成簇的细胞[5]，多数病例的瘤细胞酷似原幼淋巴细胞，当病灶很小时，往往造成误诊误治。 本研究中，我们结合细胞形态学及细胞化学染色做对比观察，为NB筛查诊断提供细胞形态学及细胞化学染色的诊断依据。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料取2008年8月～2012年6月于本院住院的NB患儿33例(病例组)，F3抗体阳性。患儿男20例、女13例，平均年龄2.18岁。对照组选自同期住院的患儿20例，F3抗体阴性。患儿男7例、女13例，平均年龄3.69岁。20例中神经节细胞瘤3例，肾母细胞瘤9例，脂肪瘤2例，横纹肌肉瘤2例，骨肉瘤1例，畸胎瘤1例，肝母细胞瘤1例，肾癌1例。

1.2方法采用骨髓穿刺法获取髂前或髂后骨髓细胞。两组分别进行骨髓细胞形态学镜检及血细胞涂片，血细胞涂片用淋巴分层液分离细胞，用甩片机甩片(瘤细胞数>10%)，形态学染色为常规瑞氏染色法。①细胞形态学：按照骨髓细胞形态学检查的质量控制[6]和具有丰富阅片经验的检验人员显微镜检，每次染色都有阳性质控涂片及阴性质控涂片作对照，并在油镜下观察原始细胞，根据胞质中颗粒数和颜色进行划分。②过氧化物酶(POX)染色：使用戊二醛-丙酮固定，水冲，加反应液，室温10 min，水洗后染色，再水洗，干燥后镜检。③碱性磷酸酶(NAP)染色：10%甲醛甲醇固定液30 s水洗，待干，涂片浸入基质孵育液，水洗待干后，镜检。④糖原(PAS)染色：新鲜干燥的涂片乙醇固定10 min，水洗待干，过碘酸液20 min水洗待干，雪夫液30 min染色，用亚硫酸液冲洗，再用水冲洗待干，复染水洗，待干，镜检。⑤单克隆抗体与NB细胞反应(APAAP)法。应用军事医学科学院提供的单克隆F3(Ⅰ抗)，荧光标记羊抗属免疫球蛋白(Ⅱ抗)进行免疫荧光染色[7]。

1.3判定标准形态学：细胞形态计数200个细胞，换算成百分率，瘤细胞占阳性的百分比，典型成团细胞和细胞呈菊花团样或砌墙样排列或看见条索状纤维丝样物质均按阳性计数。细胞化学染色：①POX染色：见胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性。无颗粒为阴性，颗粒小，分布稀疏为弱阳性；②NAP染色[8]：颗粒略粗较密集为阳性，颗粒粗大且布满于整个胞质中为强阳性，无颗粒为阴性，稍有颗粒为弱阳性；③PAS染色(常规的过碘酸-雪夫反应法)：在油镜下观察200个原始细胞，根据胞质中颗粒数和颜色划分，无颗粒为阴性，弥散性浅粉色为弱阳性，颗粒染色较深呈紫红色为阳性，红色粗大颗粒或紫红色块状为强阳性。

2　结果

2.1两组细胞形态学和细胞化学染色结果详见表1。

表1　两组细胞形态学和细胞化学染色结果[例(%)]

注：与对照组同检验方法比较，*P﹤0.01。

2.2两组细胞形态学和PAS染色诊断效能结果比较33例NB患儿中29例(87.8%)可见到细胞成团排列，或呈菊花团或砌墙排列，大部分可见紫红色条索状纤维样物质，是NB细胞特有的特征之一。对照组中的瘤细胞，细胞形态观察多数是单一的，散在的瘤细胞，个别有2～3个聚在一起的现象，无细胞成团排列，或呈菊花团或砌墙排列，未见紫红色条索状纤维样物质。两组细胞形态和PAS染色诊断效能结果比较详见表2。

表2　两组细胞形态和PAS染色诊断效能结果比较

3　讨论

单克隆F3抗体检测因其灵敏度、特异度都高，是最有效、最准确的检验方法，主要用于筛查NB。细胞形态学联合细胞化学PAS检查与F3抗体检测进行效能比较，细胞形态和细胞化学染色联合方法检测中，其灵敏度为87.9%，特异度为95%,一致率为90.6%，大大提高对NB的诊断率。PAS染色可作为NB一种重要的辅助鉴别诊断方法。

小儿NB的检测方法很多，免疫抗体检测、超声影像、骨髓镜检等,但是关于细胞化学染色，国外文献报道很少，国内更为少见，本文尝试用几种化学染色方法对NB进行检测，并比较其灵敏度和特异度，结果为POX>PAS>NAP。

POX染色主要反映细胞内过氧化物酶活性，血细胞所含的过氧化物酶主要是髓过氧化物酶，是粒细胞含量最多的一种蛋白质，本文中53例瘤细胞经POX染色结果均为阴性，表明所有瘤细胞中不含有此酶，在细胞化学染色中选用此方法，主要用于排除NB，也可鉴别粒细胞与NB细胞。操作中需要具有丰富阅片经验的检验技术人员细心计数，因试剂标准化，其成本低，有利于普及。PAS主要反映细胞内糖原、粘多糖、黏蛋白的含量。根据胞质中糖原种类及含量多少，呈现粗细不等红色颗粒、块状物质或均匀红色。NB细胞中33例阴性，仅有1例弱阳性，胞质内颗粒呈弥散性浅粉色，该物质不是颗粒，可能与机体感染或发热或药物有关，原粒细胞胞质颗粒染色较深，呈紫红色。原幼淋巴细胞呈红色粗大颗粒或紫红色块状。

NAP染色可反映粒细胞内NAP活性。部分肿瘤患儿NAP增高可能与机体炎症反应有关，如发热、药物反应等。本文中，NAP染色诊断NB的灵敏度和特异度分别为48.5%和15.0%，说明NB的筛查用此方法不特异。

细胞形态学观察是不可替代的重要检查方法。NB瘤细胞具有成团聚集或呈菊花式排列特点，而一般瘤细胞无此特点。本研究结果显示，细胞形态学联合PAS检查灵敏度及特异度均高于单独细胞形态学及PAS染色。提示细胞形态学结合PAS可提高NB的诊断率，细胞形态学方法简单，便于基层医院应用。

NB有早期转移的特点，当诊断为NB时应把骨髓涂片细胞学作为常规检查[8]。早期转移骨髓象表现为骨髓增生活跃，粒、红、巨三系大致正常，少量NB细胞混杂于正常细胞之间，骨髓涂片染色镜检寻找瘤细胞[9]显得十分必要。严重骨转移时，NB细胞占优势，易误认为白血病。细胞形态学上瘤细胞具有成团聚集，或呈“菊花团”状聚集，且瘤细胞间有嗜酸性粉红色纤维丝状物[10]，而原淋巴细胞和粒细胞无此特点；同时在NB伴有粒系、红、巨三系不受抑制的特点，而白血病无论是急性淋细胞白血病还是急性粒细胞白血病，骨髓细胞多为单一一种细胞，并且有粒、红、巨三系受抑现象；神经母细胞团周围和散在神经母细胞之间可见紫红色粗细不等的条索样纤维物质，而急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病骨髓细胞形态中无此现象。这一重要的形态特点，可作为NB与急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血症鉴别的重要依据。当疑似NB时，应把骨髓涂片细胞学作为常规检查，PAS可提高NB的诊断率，其可作为NB诊断和鉴别诊断重要的辅助方法。

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郑锐(E-mail:shanlinyu33@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.029

R730.4

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1002-266X(2016)17-0077-03

2015-09-08)