不同浓度地西他滨对破骨细胞分化的影响

糜宝国　关邯峰　刘常宇　雷琢玮　宋超　刘慧勇　邓杝　熊伟　廖晖　方忠　李锋

·实验研究论著·

不同浓度地西他滨对破骨细胞分化的影响

糜宝国关邯峰刘常宇雷琢玮宋超刘慧勇邓杝熊伟廖晖方忠李锋

目的探讨不同浓度梯度地西他滨对破骨细胞形成、活性及吸收功能的影响。方法不同浓度地西他滨（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）处理单核巨噬（RAW264.7）细胞。通过4’，6⁃联眯⁃2⁃苯基吲哚（4，6⁃Diamidino⁃2⁃phenylindole dihydrochloride，DAPI）染色和微丝绿色荧光探针（F⁃actin⁃Trakcer Green）染色后观察F⁃actin环的形成即破骨细胞轮廓；抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒检测细胞上清中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性，骨板吸收实验检测破骨细胞的骨吸收能力；Q⁃PCR实验检测破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate⁃resistant acid phosphatase，TRAP）、组织蛋白酶K（cathepsin K，CK）和脊髓基质金属蛋白酶⁃9（matrix metalloproteinase⁃9，MMP⁃9）的mRNA表达。结果不同浓度地西他滨抑制核因子NF ⁃κB配体激活因子（receptor activator of NF⁃κB ligand，RANKL）诱导RAW264.7细胞形成F⁃actin环，降低了破骨细胞的TRAP酶活性，抑制了破骨细胞的骨吸收能力，同时也下调了破骨细胞标志基因TRAP、CK和MMP⁃9的mRNA表达。且随着药物浓度的增高，上述的抑制作用越明显。结论地西他滨抑制破骨细胞形成、活性和骨吸收能力，且这种抑制作用随着药物浓度的增加而逐渐增强。

破骨细胞；细胞分化；RNA干扰

骨重塑过程是通过成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的循环来实现的。破骨细胞来源于骨髓单核巨噬细胞系，由多核巨噬细胞组成，在人体生理性骨重建和病理性骨破坏过程中发挥着重要作用［1，2］。

近年来，随着对破骨细胞分化调控机制的认识加深，NF⁃κB配体激活因子（receptor activator of NF⁃κB ligand，RANKL）在破骨细胞分化、成熟和活化过程中的作用备受关注。RANKL/NF⁃κB受体激活因子（receptor activator of NF⁃κB，RANK）/护骨素（osteo⁃protegerin，OPG）通路在骨代谢中起到主要调控作用［3，4］。

地西他滨（decitabine）是一种DNA去甲基化药物，可以逆转DNA过度甲基化，使因过度甲基化而致缄默的基因重新表达［5］。基因组甲基化水平在造血干细胞中最高，分化过程中甲基化水平逐渐降低。尤其是向髓系分化时，基因组的DNA甲基化产生了巨大的改变。由于地西他滨可促进急性髓细胞白血病（acute myelogenous leukemia，AML）细胞分化［6］。破骨系细胞属于髓系细胞，起源于造血干细胞，所以基于以上研究结果，我们猜测地西他滨可能在破骨细胞发生和功能中起着一定的作用。

我们通过前期实验研究发现地西他滨可以抑制破骨细胞的分化、形成和功能，同时也阐述了地西他滨抑制破骨分化的相关分子机制［7］。然而，前期的实验中未明确表明不同浓度地西他滨对破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate⁃resistant acid phospha⁃tase，TRAP）酶活性和骨板吸收实验的影响，也未阐述不同浓度地西他滨对破骨细胞F⁃actin环形成的影响。因此，本次实验基于前期实验的研究基础之上，选取了安全有效的药物浓度，即不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）的地西他滨［7］。本文旨在进一步阐述不同浓度地西他滨对破骨细胞F⁃actin环形成的影响，以及明确不同浓度梯度地西他滨对破骨细胞TRAP酶活性和骨吸收能力的影响。

材料与方法

一、试剂与材料

胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、D⁃MEM培养基分别购自美国Gibco和HyClone公司。RAW264.7细胞购自中国科学院细胞库，重组小鼠RANKL来源于美国R&D公司。地西他滨购于美国BioVision公司，聚苯乙烯骨表面分析微孔板购自美国Corning公司。4’，6⁃联眯⁃2⁃苯基吲哚（4，6⁃diamidino⁃2⁃phenyl⁃indole dihydrochloride，DAPI）、微丝绿色荧光探针（F ⁃actin⁃Trakcer Green）试剂盒购于中国碧云天生物技术公司。

二、细胞培养与诱导分化

37℃含5%CO2湿化空气培养箱中，用含体积分数10%胎牛血清，100 μ/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM完全培养基培养单核巨噬（RAW264.7）细胞。待细胞长满瓶底的80%左右时进行传代培养，每3天换1次液。

RAW264.7细胞是破骨细胞前体细胞，在诱导因子RANKL的诱导作用下可向破骨细胞分化。将RAW264.7细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，用含体积分数10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM完全培养基培养。24 h后待细胞完全贴壁生长稳定后，用50 ng/ml RANKL诱导培养。每隔1 d更换诱导培养基1次。诱导培养5 d后在镜下观察，可发现多个RAW264.7细胞相互融合，形成了多核细胞（核数≥3）。

三、F⁃actin环的形成和DAPI染色

RAW264.7细胞以5×103个/孔的密度接种在96孔板中，待细胞生长稳定完全贴壁后，分别用不同浓度地西他滨（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L、）处理24 h后更换培养液。50 ng/mL RANKL诱导培养5 d后根据说明书染色步骤行F⁃actin荧光染色和DAPI荧光染色。最后置于荧光显微镜下拍照分析。

四、抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测

RAW264.7细胞以5×103个/孔的密度接种在96孔板中，待细胞生长稳定完全贴壁后，分别用不同浓度地西他滨（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）处理24 h后更换培养液。50 ng/ml RANKL诱导培养5 d后用TRAP检测试剂盒检测细胞上清中TRAP酶的活性。实验方法采用李勇等［8］所述，步骤如下：将96孔板中的细胞用PBS冲洗2次，用1%的Triton⁃100裂解细胞30 min；充分裂解后，移入到EP管中，离心收集上清液；分别设置空白对照、标准品和样品组，空白组依次加入检测缓冲液、显色底物和酒石酸溶液。标准品组依次加入检测缓冲液、酒石酸溶液和标准品工作液；样品组依次加入检测缓冲液、显色底物、酒石酸溶液和样品；用枪头吹打混匀后37℃孵育30 min；每孔加入反应终止液终止反应，于405 nm测定吸光度。

五、骨板吸收实验

将RAW264.7细胞以5×103个/孔的密度接种于聚苯乙烯骨表面分析微孔板中，用含体积分数10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM完全培养基培养。50 ng/ml RANKL诱导培养5 d待破骨细胞形成后［7，9］，用不同浓度地西他滨（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）处理24 h，然后更换培养液，继续用50 ng/ml RANKL诱导培养3 d，使得分化成熟的破骨细胞充分发挥其骨吸收能力。最后用漂白液洗去培养板上的细胞，待骨表面分析微孔板干燥后在倒置显微镜下观察骨陷窝形成情况并拍照，Image⁃pro plus6.0图像分析软件对图像进行分析。

六、总mRNA的提取及Q⁃PCR检测

将RAW264.7细胞接种在6孔板中，待细胞完全贴壁，生长稳定后用不同浓度地西他滨（0、0.1、0.25 和0.5 μmol/L）处理24 h后更换培养液。50 ng/ml RANKL诱导培养5 d后用提取总RNA，合成cDNA用于Q⁃PCR检测。

Q⁃PCR实验中所用引物序列如下：

1.TRAP上游引物：5′⁃GATGCCAGCGA⁃CAAGAGGTT⁃3′，下游引物：5′⁃CATACCAGGGGAT⁃GTTGCGAA⁃3′。

2.组织蛋白酶K（cathepsin K，CK） 上游引物：5′⁃GAAGAAGACTCACCAGAAGCAG⁃3′，下游引物：5′⁃TCCAGGTTATGGGCAGAGATT⁃3′。

3.脊髓基质金属蛋白酶⁃9（matrix metallopro⁃teinase⁃9，MMP⁃9） 上游引物：5′⁃CTGGACAGC⁃CAGACACTAAAG⁃3′，下游引物：5′⁃CTCGCG⁃GCAAGTCTTCAGAG⁃3′。

4.β⁃actin上游引物：5′⁃ATTTCTGAATGG⁃CCCAGGT⁃3′，下游引物：5′⁃CTGCCTCAACACCT⁃ CAACC⁃3′。

反应体系（总体积10 μl）：引物0.5 μl，2×Trans Start Green Mix 5 μl，模板（cDNA）0.5 μl，DEPC水4 μl。

反应条件为95℃30 min，1个循环；95℃2 s，60℃30 s，40个循环。

七、统计学分析

应用SPSS 18.0（SPSS公司，美国）统计软件进行数据处理分析，所有数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析ANOVA和SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1　F⁃actin环染色　不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨处理RAW264.7细胞，经RANKL诱导培养后行F⁃actin染色和DAPI染色，可见：与地西他滨浓度为0 μmol/L组相比，浓度为0.1 μmol/L时，F⁃actin环的大小和数目无明显差异；浓度为0.25 μmol/L和0.5 μmol/L时，形成的F⁃actin环较小，并且数目明显减少

结果

一、F⁃actin和DAPI荧光染色

不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨处理RAW264.7细胞24 h，经50 ng/ml RANKL诱导培养5 d后行F⁃actin绿丝荧光染色可见（图1）：与地西他滨浓度为0 μmol/L组相比，当浓度为0.1 μmol/L时，F⁃actin环的大小和数目无明显差异；浓度为0.25 μmol/L和0.5 μmol/L时，形成的F⁃actin环较小，并且数目明显减少；随着地西他滨浓度的增加，F⁃actin环的轮廓逐渐减小，数目逐渐减少，即地西他滨对破骨细胞F⁃actin环形成的抑制作用呈剂量依赖性。

二、TRAP活性检测

TRAP检测试剂盒检测酶活性结果显示（图2）：与地西他滨浓度为0 μmol/L组相比，当浓度为0.1、0.25和0.5 μmol/L时，TRAP酶在405 nm处测定的吸光度（A405）逐渐降低。吸光度越高表示TRAP酶活性越强。0.1 μmol/L组、0.25 μmol/L组和0.5 μmol/L组与0 μmol/L组分别比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

三、骨板吸收实验

破骨细胞接种到骨板上后骨吸收的情况显示被吸收的地方呈蚕食样改变（图3）。0 μmol/L地西他滨组中可见明显的骨陷窝形成；0.1 μmol/L组中骨陷窝稍有减少；0.25 μmol/L组和0.5 μmol/L组中的骨陷窝明显减少。

0.25 μmol/L组、0.5 μmol/L组分别与0 μmol/L地西他滨组的骨板吸率（不同浓度地西他滨组的骨吸收陷窝面积百分比）相比，差异均有统计学意义（P＜0.05，图4）。

四、Q⁃PCR实验

不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨处理RAW264.7细胞，经RANKL诱导培养后行破骨细胞标志基因的mRNA检测。Q⁃PCR结果示（图5）：当地西他滨浓度为0.1、0.25、0.5 μmol/L时与0 μmol/L组相比，TRAP、CK和MMP⁃9的mRNA表达量逐渐降低。0.25 μmol/L组、0.5 μmol/L组分别与0 μmol/L组相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

讨论

图2　TRAP酶活性检测　不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨处理RAW264.7细胞，经RANKL诱导培养后行TRAP酶活性检测：0.1、0.25、0.5 μmol/L组与0 μmol/L组分别比较，差异均有统计学意义（均*P＜0.05）

图3　骨板吸收实验　不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨处理RAW264.7细胞，经RANKL诱导培养后行骨板吸收实验检测：0 μmol/L组中可见明显的骨陷窝形成；0.1 μmol/L组中骨陷窝稍有减少；0.25 μmol/L组和0.5 μmol/L组中的骨陷窝明显减少

图4　骨板吸率　不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨组的骨吸收陷窝面积百分比：0.25 μmol/L组、0.5 μmol/L组分别与0 μmol/L组骨板吸率相比，差异均有统计学意义（*P＜0.05）

图5　Q⁃PCR实验　不同浓度梯度（0、0.1、0.25和0.5 μmol/L）地西他滨处理RAW264.7细胞，经RANKL诱导培养后行破骨细胞标志基因的mRNA检测：0.25 μmol/L组、0.5 μmol/L组分别与0 μmol/L组相比，差异均有统计学意义（均*P＜0.05）

破骨细胞是骨组织特异性的多核巨噬细胞，由造血干细胞经由单核-巨噬细胞前体细胞分化而来。破骨细胞与成骨细胞共同参与骨代谢的调节，对骨代谢平衡的维持起着至关重要的作用［10］。RAW264.7细胞是破骨前体细胞，具有易培养、可无限传代和稳定性好等优点。与破骨前体细胞相比，破骨细胞主要具有以下特点：①细胞形态较大、核多；②可生成多种特异性蛋白，包括TRAP、CK和MMP⁃9等［11］；③具有骨吸收功能。TRAP染色和TRAP酶活性检测时检测破骨细胞形成和活性的常规实验方法，通过骨板吸收实验检测破骨细胞的吸收功能。然而F⁃actin和DAPI荧光染色也可以用于观察破骨细胞的形态和轮廓。在本研究中，通过F⁃actin和DAPI荧光染色观察破骨细胞形态和轮廓的变化、抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒检测TRAP活性间接反映破骨细胞活性、通过骨板吸收实验以及Q⁃PCR等方法来评价不同浓度地西他滨对破骨细胞分化的影响。结果从形态特征、破骨细胞活性和功能状况等方面均证明了地西他滨对破骨细胞形成、活性及功能的影响呈药物剂量依赖性。

地西他滨是一种DNA甲基化抑制剂，目前在临床上主要用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓细胞白血病等恶性血液系统疾病。地西他滨通过抑制MYC基因的表达而发挥抗肿瘤的作用［12］。我们前期研究结果发现地西他滨可以抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化。本次研究基于前期实验结果的基础之上，选用了安全有效的药物浓度，观察了不同药物浓度对破骨细胞形成、活性和功能的影响。实验结果进一步明确了地西他滨对破骨细胞分化的抑制作用，且这种抑制作用呈药物剂量依赖性表现。

综上所述，本研究结果表明不同浓度地西他滨对破骨细胞F⁃actin环的形成、破骨细胞活性和破骨细胞吸收功能的抑制作用呈剂量依赖性关系。

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Effect of different concentrations of decitabine on osteoclast differentiation.

MI Baoguo，GUAN Hanfeng，LIU Changyu，LEI Zhuowei，SONG Chao，LIU Huiyong，DENG Yi，XIONG Wei，LIAO Hui，FANG Zhong，LI Feng.Department of Orthopaedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

LIFeng，E⁃mail：lifengmd@hust.edu.cn；FANGZhong，E⁃mail：zhongfangtjh@yahoo.com

ObjectiveTo explore the effect of different concentrations of decitabine on osteoclast for⁃mation，activity and osteoclasts resorptive capacity.MethodsRAW264.7 cells were treated with decitabine at different concentrations（0，0.1，0.25，0.5 μmol/L）.Osteoclast differentiation was assessed by DAPI and F⁃actin⁃Trakcer Green staining tests.Tartrate⁃resistant acid phosphatase kit was used to evaluate TRAP activity.Osteo⁃clasts resorptive capacity was detected by bone resorption test.The expression of osteoclast specific genes like TRAP，capthesin K，and MMP⁃9 mRNA was detected by RT⁃PCR.ResultsDifferent concentrations of decitabine inhabited RANKL⁃stimulated osteoclastogenesis in RAW264.7 cell culture，as manifested by de⁃crease of F⁃actin rings formation，TRAP activity and osteoclasts resorptive capacity in a dose⁃dependent man⁃ner，and also down⁃regulated TRAP，CK，and MMP⁃9 mRNA expression.ConclusionDecitabine inhabited os⁃teoclast formation，activity and osteoclasts resorptive capacity in a dose⁃dependent manner.

Osteoclasts；Differentiation；RNA interference

10.3969/j.issn.1674⁃8573.2016.02.012

中央高校基本科研业务费专项基金资助（2014TS074）；湖北省自然科学基金（2014CFB196）

430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科

李锋，E⁃mail：lifengmd@hust.edu.cn；方忠，E⁃mail：zhong⁃fangtjh@yahoo.com

（2015⁃09⁃03）