河南汉族父亲MTHFR基因对母亲不明原因反复自然流产的影响*

郭谦楠，冯战启，康　冰，王　瑜,邢孟艳，龙建纲

(1.西安交通大学生命科学与技术学院线粒体生物医学研究所，西安 710049；2.河南省人民医院/郑州大学人民医院医学遗传所，郑州 450003;3.河南省郑州市第一人民医院泌尿外科,郑州 450000)



·论著·

河南汉族父亲MTHFR基因对母亲不明原因反复自然流产的影响*

郭谦楠1,2，冯战启3，康冰2，王瑜2,邢孟艳2，龙建纲1△

(1.西安交通大学生命科学与技术学院线粒体生物医学研究所，西安 710049；2.河南省人民医院/郑州大学人民医院医学遗传所，郑州 450003;3.河南省郑州市第一人民医院泌尿外科,郑州 450000)

目的探讨父亲亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性是否与母亲不明原因反复自然流产(URSA)的发生有关。方法通过聚合酶链式反应-测序(PCR-测序)的方法对329对河南汉族URSA夫妇(观察组)及292对河南汉族健康夫妇(对照组)基因型进行分析。 结果无论是在对照组中还是观察组中，男、女之间的MTHFR C677T多态性位点的C和T等位基因频率和各基因型频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)；观察组中男女各方的MTHFR C677T多态性位点的T等位基因频率和含T的各基因型频率均显著高于相应的对照组(P<0.05)，在女性中T等位基因是C等位基因发生URSA风险的2.267倍(95%CI：1.804～2.843)，在男性中T等位基因是C等位基因发生URSA风险的2.239倍(95%CI：1.783～2.811)。夫妻联合基因型分析中，夫妇 TT/TT基因型发生URSA的风险最高，是CC/CC基因型夫妇的19.909倍(95%CI：8.608～46.049)。结论父母的MTHFR 677C>T是URSA发生的独立遗传易感因素。

亚甲基四氢叶酸还原酶;流产，习惯性；原因不明;同型半胱氨酸

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢途径中的关键酶，突变可导致其酶活性的降低，牵制5,10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)向5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的转化。5-MTHF是体内主要的蛋白质和DNA甲基供体，参与同型半胱氨酸(Hcy)向蛋氨酸的转化，进而影响后续的蛋氨酸代谢循环和DNA的合成、修复及甲基化。因此，MTHFR与叶酸的新陈代谢、DNA 的遗传稳定性和维持正常的Hcy血清水平密切相关。MTHFR的多态性基因位点C677T已被证实与其编码酶的活性、血清叶酸和血浆同型半胱氨酸浓度密切相关。MTHFR C677T多态性位点与红细胞和血清叶酸浓度、血浆Hcy浓度，以及心血管疾病易感性的关联性研究在国内外都比较深入,TT基因型人群的红细胞叶酸和血清叶酸的浓度均显著低于野生CC基因型人群[1-2]，但血浆Hcy的浓度却显著增高[1-2]；并且T等位基因是心血管疾病发生的遗传易感因素。

国内外在URSA方面的研究揭示女性MTHFR C677T的T等位基因是URSA的遗传风险因素[3-4],并且与包括不明原因反复自然流产(URSA)在内的不良妊娠均相关[5]，但URSA与男性MTHFR基因相关性的研究鲜见报道。近年来国内外的研究表明，MTHFR C677T多态性位点与男性不育有关并可能会影响精子质量[6-8]，暗示男性的C677T多态性可能与其配偶发生URSA有关。王亚文等[9]在32个小标本量中国人群中的调查仅发现男性的MTHFR C677T基因型只有与女性联合分析时才有意义，单独分析时无意义。因此，本研究旨在探讨是否男性像女性一样其男性的MTHFR C677T基因多态性与URSA的发生有关，这种关联性是男性独立存在的还是必须和其女性配偶双方一起时才存在，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料均采集在河南居住的河南籍汉族夫妇双方外周血血液标本。 观察组329对夫妇(女：25～32岁；男：27～34岁)，5～12周URSA≥2次，未曾有过正常妊娠，双方身体健康，无生殖系统结构异常，无明显肥胖，无家族遗传病史，无支原体、衣原体及常见的病毒细菌感染，无内分泌异常且染色体核型均正常。对照组292对夫妇(女：24～32岁；男：27～34岁)，身体健康，无明显肥胖，无家族遗传病史，无任何不良妊娠史和重大疾病史，并曾至少生育有1名健康子女，且女方至少在妊娠前2个月内和妊娠后早期1个月内未曾服用过人工叶酸制剂，男方则从未服用过人工叶酸制剂。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取抽取外周血静脉血2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃保存。利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取DNA。

1.2.2PCR-直接测序分析基因型(1)MTHFR C677T位点扩增的引物设计：参照GenBank中MTHFR基因序列，采用Primer5软件设计PCR引物。C677T位点上游引物TP1：5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GCT G-3′,下游引物TP2：5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TTC-3′,由上海生物工程公司合成，蒸馏水稀释至10 μmol/L。(2)反应条件为95℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72℃ 30 s共40个循环，随后72 ℃延伸9 min。(3)运用下游引物TP2进行PCR产物基因序列测序(PCR产物送上海生物工程公司测序)。

1.3统计学处理采用SPSS13.0进行统计学分析，通过基因型频率计算等位基因频率，以Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性。基因型以及基因频率分布的比较采用Personχ2检验。关联分析用χ2检验和Logistic回归，必要时用Fisher精确概率检验，计算比值比(Odds ratios，ORs)评价相对危险度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1MTHFR C677T多态性位点反向测序结果基因序列测序见图1。

A：CC纯合基因型；B：TT纯合基因型。

图1MTHFR C677T多态性位点反向测序结果

2.2MTHFR C677T等位基因频率的分布两组MTHFR C677T多态性基因位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，具有群体代表性。经χ2检验(T等位基因分布差异研究以C等位基因为参照来进行统计学分析)：MTHFR C677T在对照组女性T等位基因频率为39.7%，观察组女性为59.9%，对照组男性为42.6%，观察组男性为62.5%。两组内男女之间的频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，即C677T的多态性分布在各组内均无性别差异，见表1。观察组中T等位基因频率比对照组中男、女均显著提高(女性之间，χ2=50.264，P=0.000，OR=2.267，95%CI：1.804～2.843；男性之间，χ2=48.834，P=0.000，OR=2.239，95%CI：1.783～2.811)；女性T等位基因是C等位基因发生URSA风险的2.267倍，男性T等位基因是C等位基因发生URSA风险的2.239倍。

表1　MTHFR C677T基因位点多态性在男、女双方中分布情况的比较[n(%)]

2.3不同性别MTHFR C677T基因型分析结果经Logistic回归分析,观察组与对照组中各基因型频率分布以见表2。采用χ2计算，含T的各基因型分布差异研究分别以CC基因型为参照来进行统计学分析。携带MTHFR 677CT基因型女性发生URSA的风险是677CC女性的2.126倍(χ2=14.208，OR=2.126，95%CI：1.432～3.157，P<0.05)，MTHFR 677TT基因型女性发生URSA的风险是677CC女性的4.666倍(χ2=45.779，OR=4.666，95%CI：2.953～7.371，P<0.05)；携带MTHFR 677CT基因型男性使其女性伴侣发生URSA的风险是677CC男性的2.178倍(χ2=13.943，OR=2.178，95%CI：1.442～3.288，P<0.05)，MTHFR 677TT基因型男性使其女性伴侣发生URSA的风险是677CC男性的4.632倍(χ2=44.829，OR=4.632，95%CI：2.923～7.338,P<0.05)。

表2　两组MTHFRC677T基因型分布

2.4男女配对MTHFR C677T基因型合并分析经Logistic回归分析,观察组与对照组中各基因型频率分布以及比值比等数据见表3。从4个T到1个T的统计学分析均以0个T为参照对象进行统计学分析。夫妻为TT/TT基因型组合时，URSA发生的风险最大。夫妻双方为4个T基因型(TT/TT)时发生URSA的风险是双方为0个T(CC/CC)基因型的19.909倍(95%CI：8.608～46.049，P<0.05)，夫妻双方为3个T基因型(CT/TT)时发生URSA的风险是双方为0个T基因型的13.273倍(95%CI：6.539～26.941，P<0.05)，夫妻双方为2个T基因型(CT/CT或者CC/TT)时发生URSA的风险是双方为0个T基因型的7.056倍(95%CI：3.528～14.110，P<0.05)，夫妻双方为1个T基因型(CT/CC)时发生URSA的风险是双方为0个T基因型的6.772倍(95%CI：3.210～14.282，P<0.05)。

表3　不良妊娠夫妇MTHFR C677T 合并基因型分析结果

3　讨　论

MTHFR C677T对酶活性的不利影响可通过饮食对叶酸摄取量的增多而得到改善。因此，不同地域和种族间不同的生活饮食习惯可能是造成C677T这个多态性位点基因频率的地域[10-11]和种族[12-13]间的差异。例如，在中国人群中，TT纯合子频率约为20%；而在非洲撒哈拉地区黑人中未发现有TT纯合突变[14]。不同的地域和种族拥有不同的基因型频率可能是造成与本文与研究结果不一致的原因。王亚文等[9]对32对URSA的夫妇进行MTHFR C677T多态性位点基因型分析研究发现，仅夫妻双方都是纯合或杂合突变型,其基因型分布与流产发生的危险性相关，夫妻双方有一人是纯合或杂合突变型,而另一人为野生型的,其基因型分布与流产发生的危险性无关，其研究未对样本进行地域和种族差异的区分且样本量偏小；另一方面，王亚文等[9]的研究未考虑对照组在妊娠前和妊娠早期是否有服用人工叶酸制剂。本研究中所选的病例和对照组样本量大，对照组男性均为未曾服用过人工叶酸制剂的人群，女性则至少在妊娠前2个月内和妊娠第1个月内未曾服用过人工叶酸制剂,从而在一定程度上排除了由于服食叶酸改善了MTHFR酶活性继而正常妊娠的高风险基因人群纳入对照，保证了对照的可信性，使突变等位基因T对URSA发生的影响更加准确地得到反映。

本文研究证实父亲和母亲的MTHFR C677T多态性位点与母亲URSA的发生密切相关。在母亲方面，MTHFR C677T 多态性位点T等位基因和TT基因型与URSA的发生风险相关已得到国内外文献的报道[3-4]，与本研究发现一致。

在父亲方面，其MTHFR C677T多态性位点与URSA发生的风险易感性可独立于母亲基因型单独成立可能来源于两个方面的原因。(1)父亲MTHFR基因对精子DNA遗传物质的影响作用对胚胎的正常发育有重要影响。MTHFR基因C677T的多态性位点已证实与男性不育[6-8]、精子的活动率和畸形[6,8]以及胎儿心脏畸形[15-16]有关，因此C677T的T等位基因和TT基因型造成的URSA风险易感性可能来源于其对男性精子的影响。胚胎50%的基因来源于精子，除了受孕功能，精子的基因所起的作用贯穿胚胎发育的整个过程。如果精子的遗传物质DNA发生损伤，可以不影响精子受孕功能，精子可以与卵子相遇并结合，女性同样会正常怀孕，但妊娠到一定的阶段(取决于精子DNA的损伤位置和程度)便会导致胚胎停止发育，从而出现流产现象。(2)父亲MTHFR C677T多态性位点的基因型对胎儿基因型的影响可能影响胎儿的正常发育。由表3结果可知，夫妻为TT/TT基因型时，即胎儿为TT基因型时，URSA发生的风险最高。女性MTHFR 677T等位基因和TT基因型已证实是胎儿神经管缺陷[17]和21三体综合征的遗传易感因素[18]；在成年人中也已证实MTHFR 677T等位基因和TT基因型是肿瘤癌症的遗传易感因素[19-20]。因此，在胚胎期，胎儿的MTHFR C677T的T等位基因和TT基因型可能对其本身的发育有关,而父亲MTHFR 677C>T突变增加胎儿T风险基因型的遗传概率。

本研究从男女双方按性别分组分析及合并分析的研究结果表明，男、女单独各方的MTHFR 677C>T突变均是URSA发生的遗传易感因素，当夫妻双方为TT/TT基因型时URSA发生的风险最大。已知MTHFR 677C>T突变导致的MTHFR酶活性的降低可由叶酸摄入量的增加而得到改善；在女性中，额外添加叶酸摄入量已公认对提高生育质量有帮助(降低神经管缺陷和唐氏综合征等妊娠率)。因此，鉴于男性的MTHFR基因是女性URSA发生的独立遗传危险因素，对MTHFR 677TT和677CT突变型的男性患者给予适当的叶酸补充可能也对提高生育质量和防止女性发生URSA有帮助。

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Influence of paternal MTHFR gene on maternal unexplained recurrent spontaneous abortion in Henan Han population*

GuoQiannan1,2,FengZhanqi3,KangBing2,WangYu2,XingMengyan2,LongJiangang1△

(1.InstituteofMitochondrialBiologyandMedicine,SchoolofLifeScienceandTechnology,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710049,China;2.InstituteofMedicalGenetics,HenanProvincialPeople′sHospital/People′sHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China;3.DepartmentofUrologySurgery，theFirstPeople′sHospitalofZhengzhouCity，Zhengzhou,Henan450000，China)

ObjectiveTo explore whether the paternal MTHFR gene C677T polymorphism being associated with the susceptibility of maternal unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA).MethodsTotally 329 Henan Han couples with URSA(observation group) and 292 Henan Han healthy couples were detected the MTHFR C677T genotypes by the PCR-sequencing.ResultsThe allele C and T frequencies and genotype frequencies of MTHFR C677T polymorphism site had no statistically significant difference between males and females within either URSA group or control group (P>0.05);the frequency of allele T and the frequencies of allele T-included genotypes at C677T polymorphism site were significantly increased in the males and females of the observation group compared with the control group(P<0.05).The URSA risk occurrence in the female allele T was 2.267 times of that the allele C(95%CI：1.804-2.843),while the URSA risk occurrence in the male allele T was 2.239 times of that the allele C(95%CI：1.783-2.811).In the combined genotype analysis within the couples,the URSA risk occurrence in couple TT/TT genotype was highest and was 19.909 times of that in couple CC/CC genotype(95%CI:8.608-46.049).ConclusionThe parental MTHFR 677C>T is a independent genetic susceptibility factor for URSA occurrence.

methylenetetrahydrofolate reductase;abortion,habitual;unknown origin;homocysteine

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.003

国家自然科学基金资助项目(81501336)。作者简介：郭谦楠(1984-)，硕士，助理研究员，主要从事不良妊娠基因和单基因病的研究。△

，E-mail:jglong@mail.xjtu.edu.cn。

R714.21

A

1671-8348(2016)13-1736-04

2015-11-20

2016-01-23)