建立一种伴有肾小球和肾小管间质损伤的大鼠慢性肾衰竭动物模型*

林佳如，苟芳芳，李雪英，朱婷婷，樊均明,,3△

(1.成都中医药大学中西医结合临床医学院，成都 610075；2.西南医科大学附属中医院肾病内科，四川泸州 646000；3.四川大学生物治疗国家重点实验室，成都 610041)



·论著·

建立一种伴有肾小球和肾小管间质损伤的大鼠慢性肾衰竭动物模型*

林佳如1，苟芳芳2，李雪英2，朱婷婷2，樊均明1,2,3△

(1.成都中医药大学中西医结合临床医学院，成都 610075；2.西南医科大学附属中医院肾病内科，四川泸州 646000；3.四川大学生物治疗国家重点实验室，成都 610041)

目的建立一种伴有肾小球和肾小管间质损伤的慢性肾衰竭动物模型。方法SD大鼠分为6组：正常组，阿霉素15 mg/kg组(A组)，腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(B组)，阿霉素15 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(C组)，阿霉素10 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(D组)，阿霉素5 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(E组)。进行尾静脉注射阿霉素和灌胃腺嘌呤，分别于14、28 d处死大鼠，并收集尿液、血液及肾脏。结果正常组和B、E组大鼠存活过14、28 d；E组24 h尿蛋白较B组和正常组明显增加；E组大鼠血清中血尿素氮(BUN)，血肌酐(Scr)等水平明显升高；病理切片示B、E组大鼠有不同程度的肾小管间质纤维化和肾小球减少，其病变较余组典型。结论该方法能够成功建立伴有肾小球和肾小管间质损伤的慢性肾衰竭动物模型，但药物剂量需要进一步的研究。

肾功能衰竭，慢性；肾小球；动物模型；腺嘌呤；阿霉素

慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)是各种病因引起的肾脏损害和进行性恶化的结果，是多种慢性肾病的后期阶段，表现为毒素潴留、代谢紊乱的症状。《柳叶刀》新近研究表明，从1990年到2013年，我国慢性肾脏疾病(CKD)的病死率大幅增加，上升了147%[1-2]。流行病学调查研究表明，大于18岁的成年人群中，我国CKD的患病率为10.8%[3-4]。其中，约2.0%的CKD患者会进展至终末期肾病阶段，主要通过维持性透析或肾移植来维持生命[5-7]。而CKD的动物模型是生物医学研究中所建立模拟人类CKD表现的动物模型，广泛用于人类CKD的病因、发病机制、防治技术和防治药物的探索。目前CKD尚无理想的西医理论下充分模拟自然病程的人类肾小球和肾小管损伤兼备的动物模型。建立一种理想的CRF动物模型，对于研究CRF发生机制及探寻各种延缓和阻断CRF进展的新方法，具有重要意义。本研究采用阿霉素加腺嘌呤给药的方法寻找建立接近临床实际、使用广泛、简便稳定的CRF模型，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物33只清洁级雄性SD大鼠，体质量300～350 kg，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供[批号:SCXK(渝)2012-0005]。将大鼠分为6组：正常组3只，阿霉素15 mg/kg组(A组)6只，腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(B组)6只，阿霉素15 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(C组)6只，阿霉素10 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(D组)6只，阿霉素5 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1组(E组)6只。动物饲喂全价颗粒料，自由采食和饮水。

1.1.2试剂腺嘌呤购自sigma公司(产品编号：A8626)；阿霉素购自浙江海正药业股份有限公司(批号：H33021980)。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立将大鼠适应性喂养1周，给予A、C、D、E组共4组分别一次性尾静脉注射不同剂量的阿霉素；给予B、C、D、E组共4组大鼠腺嘌呤灌胃；正常组大鼠给予同等体积的生理盐水尾静脉注射及灌胃。在连续灌胃5 d后除B组外的造模组进行隔天灌胃。

1.2.2标本的收集选取每组中的3只大鼠，分别于灌胃后第14、28天处死，处死前1 d将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液测尿量。水合氯醛麻醉后，右股动脉采血。

1.2.3检测方法

1.2.3.1生化指标的测定全自动生化分析仪检测尿蛋白、血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)、血钾(K+)、血钙(Ca2+)、血磷(P+)。

1.2.3.2肾常规病理检查肾组织经固定，包埋，切成3 μm厚石蜡切片，经苏木素-伊红(HE)，光镜下观察肾小球、肾小管间质病理形态学改变。

2　结　　果

2.1各组大鼠一般存活状态、死亡时间及病死率比较第1周内A、C、D组的老鼠全部死亡。E组大鼠死亡1只。在这1周期间，A、C、D组大鼠出现不同程度的腹泻，食量下降且活动减少，喜蜷缩，足、腹、睾丸出现不同程度的水肿，以睾丸水肿最为明显，毛发凌乱，无光泽，且这3组大鼠均有不同程度的便血，尾巴、四肢及耳朵苍白，尿量减少。其他组大鼠也出现了不同程度的不良反应，但均无上述3组明显。正常组被毛光亮，活泼好动，双目有神，饮食正常，二便正常，无消瘦及腹胀大等症状。第2周内E组死亡2只，并处死正常组大鼠2只，B组2只，E组1只。B组及E组大鼠出现食量下降且活动减少，喜蜷缩，足、腹、睾丸出现轻度的水肿，毛发凌乱，无光泽，尾巴、四肢及耳朵苍白，体质量下降。第3～4周期间B组2只大鼠死亡。存活的大鼠的症状较前2周严重，其中E组怕冷，喜蜷缩更严重。B组和E组大鼠的病死率均为90%，其余造模组由于剂量过大均全部死亡。

2.2大鼠体质量的变化情况及肾脏形态改变各造模组均有不同程度的体质量下降，因造模过程中大鼠死亡，仅对最终存活大鼠做统计分析。2周后各造模组大鼠体质量均明显下降，见表1。正常组肾脏呈蚕豆样，大小正常，形态规整，颜色为红褐色，质地坚实，体积正常无肿大，有光泽；切面皮质呈正常红褐色，髓质颜色浅红，皮髓质分界清楚；组织学未见明显病理改变。E组及B组肉眼观大鼠肾体积明显增大，整个肾脏呈灰白色；切面皮质变薄，皮髓质分界不清楚。

表1　　大鼠灌胃前后体质量的变化±s，kg)

a：P<0.05，与灌胃前比较。

A：正常组肾脏病理；C、E：B组肾脏病理；B、D：E组肾脏病理。A～C：造模后2周肾脏病理；D～E：造模后4周肾脏病理。

图1肾脏组织病理变化(×10)

2.3大鼠24 h尿蛋白正常组在造模后2、3、4周24 h尿蛋白分别为(11.16±1.47)mg/24 h、(13.5±0.71)mg/24 h、(19.67±4.04)mg/24 h。B组在造模后2周24 h尿蛋白(17.16±3.34)mg/24 h，造模3、4周后大鼠死亡较多，但24 h蛋白尿在造模后3周达到31 mg/24 h，4周后达到69 mg/24 h。E组在造模后2周24 h尿蛋白 (12.5±1.7) mg/24 h，造模3、4周后大鼠死亡较多，但24 h蛋白尿在造模后3周达到104 mg/24 h，4周后达到241 mg/24 h。与正常组及B组的大鼠比较，E组大鼠在3周、4周末其24 h尿蛋白水平明显增加，且随时间延长24 h尿蛋白定量逐渐增加。

2.4大鼠血液生化指标与正常组及B组大鼠比较，E组CRF大鼠模型已经基本制备成功，测定CRF比较有代表性的指标，如BUN、Scr等明显升高，K+、Ca2+、P+代谢紊乱，见表2。

表2　　大鼠2周、4周时血液生化指标变化

2.5大鼠肾脏病理改变镜下各组肾组织HE染色，可以看出造模后2周，与正常组(图1A)相比，E组(图1B)可见局部肾小管扩张，肾间质轻度纤维化，肾小球轻度缩小；B组(图1C)可见肾小管扩张明显，间质轻度纤维化，肾小球病变不明显。造模后4周与正常组相比，E组(图1D)大鼠肾小管扩张，颗粒管型、蛋白管型，肾间质纤维化，肾小球明显缩小，相对减少，上皮细胞脱落、损伤；B组(图1E)可见肾小管扩张，肾小管间质轻度纤维化。

3　讨　　论

3.1CRF大鼠模型的建立现在CRF大鼠的造模方法主要有以下3种：(1)腺嘌呤型动物模型。腺嘌呤是广泛应用于临床的抗肿瘤类药物。研究表明，腺嘌呤引起肾小管间质纤维化的机制为经消化道吸收入血，在肝内形成极难溶于水的2,8-二羟基腺嘌呤，并在肾内大量沉积形成结晶，阻塞、压迫肾小管引起肾小管上皮损伤和肾间质肉芽肿性炎症，晚期出现肾小管间质纤维化。文献中模型的制备有50～300 mg/kg不同剂量给予大鼠每天连续灌胃，一般至少4周后Scr、BUN水平明显升高，此法方法简便，肾衰现象明显，成功率相对偏高。但主要是偏向于肾小管间质纤维化的研究。(2)阿霉素型动物模型。阿霉素是含醌的蒽环抗生素，可在肾脏内代谢还原为半醌型自由基。后者与氧反应产生活性氧，诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应,影响糖蛋白代谢，破坏滤过膜的结构和功能，最终导致膜滤过屏障的选择性变化而引起蛋白尿[8]。阿霉素的注射方式尾静脉注射1次、2次、多次等，但大多以2次注射为主，剂量4～15 mg/kg。Arioka 等[9]用15 mg/kg诱导出大鼠CRF的动物模型。王晨丹等[10]给大鼠尾静脉分2次注射阿霉素， 第1次注射按6 mg/kg给药， 第2次注射于1周后按4 mg/kg给药；大鼠在第11周末可见部分肾小球出现局灶节段性硬化。该实验阿霉素建立的CRF动物模型病理改变主要以肾小球的硬化为其特点，且时间较长。(3)手术诱导CRF模型。运用单侧肾切除等物理方法造成大量肾组织破坏，残余肾单位的功能代偿性增强，引起残余肾单位的高滤过蛋白尿，导致肾小球硬化为主要特点的CRF。薛痕等[11]观察了单侧输尿管结扎大鼠模型中的肾脏病理改变，发现可以快速建立肾脏细胞转分化和间质纤维化动物模型。尚小梅等[12]和Xiao等[13]制造大鼠 5/6 肾切除CRF模型，12 周后肾脏病理检查发现局灶性肾小球硬化、肾小囊扩张、局灶性肾间质纤维化。但是手术建立的模型病死率相对偏高，大鼠感染的危险增加，且制备模型的周期更长。(4)其他类型造模方式。例如手术加药物注射同时进行，徐海山等[14]过单侧肾切除+阿零素(4.0 mg/kg)股静脉注射8周后可制备慢性进展性肾病大鼠模型。但此种类型的大鼠模型病死率相对较高。

3.2创新性建立CRF大鼠模型纵观国内建立CRF大鼠的模型，以阿霉素和腺嘌呤为肾脏病研究的经典模型，而本实验创新性地将尾静脉注射阿霉素与腺嘌呤灌胃结合起来，拟建立一种更加理想的CRF动物模型，即是肾小管间质纤维化，肾小球硬化的动物模型。而在本实验中由于阿霉素对心脏、肝脏、骨髓等系统具有较强的毒性，而阿霉素是使用的一次性注射，且最大剂量为15 mg/kg，故单次大剂量注射是使本次造模病死率高的原因之一。

本研究发现大鼠的临床表现较单独注射阿霉素或灌胃腺嘌呤更加典型。24 h尿蛋白定量显示混合药物组较单独使用腺嘌呤或阿霉素肾小球的损害更加严重，E组给药后第3周尿蛋白大于100 mg/24 h；混合药物组生化指标对肾脏的损害更加严重，并有明显的高胆固醇血症及电解质代谢紊乱；病理切片方面随着时间的增长混合使用药物的大鼠病变较单独注射阿霉素或灌胃腺嘌呤更加典型，并符合CRF的病理改变，且模型大鼠普遍有不同程度的水肿,更接近临床实际。

以上研究结果证实本实验能够有效地建立肾小管间质纤维化伴有微小病变病理类型及大量蛋白尿的大鼠动物模型。本实验中因为A、C、D组SD大鼠死亡较多，存活例数较少故按照统计学原则只能列出数据反映实验结果，不能进一步做统计学分析。而大剂量的阿霉素不能制备此种动物模型，应该将阿霉素的剂量控制在5 mg/kg左右，在小剂量范围内探索两种药物建立CRF大鼠动物模型，也可考虑2次尾静脉注射来改良此方法。此外，阿霉素作用于大鼠的时间偏短，因此早期肾小球的病理改变主要以微小病变型病理改变为主，需要进一步做电镜观察其病理改变。

综上所述，本研究采用阿霉素尾静脉注射加上腺嘌呤灌胃建立CRF的大鼠动物模型基本成功，模型中出现了典型的病理改变、大量蛋白尿，以及各项生化指标的异常。但是大鼠死亡较多，且病理切片中肾小球硬化不明显，可能是阿霉素的剂量及注射方式有待调整，相应的数据还有待完善。但是可以初步得出结论：采用阿霉素尾静脉注射加上腺嘌呤灌胃建立CRF的大鼠动物模型，进行多层次地分组注射不同剂量阿霉素，大剂量阿霉素大鼠病死率较高，还需进行小范围剂量的探索研究，探究更准确的适用于CRF的大鼠动物模型。

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Investigation of a novel rat chronic renal failure model with glomerular and tubulointerstitial injury*

LinJiaru1,GouFangfang2,LiXueying2,ZhuTingting2,FanJunming1,2,3△

(1.DepartmentofInternalMedicine,ChengduUniversityofT.C.M,Chengdu,Sichuan610075,China；2.UrologyDepartment,SouthwestMedicalUniversity，Luzhou,Sichuan646000,China；3.LaboratoryofPsychiatry，StateKeyLaboratoryofBiotherapy，SichuanUniversity，Chengdu，Sichuan610041，China)

ObjectiveTo investigate the parameters of the chronic renal failure model with interstitial fibrosis and glomerulosclerosis.MethodsThe rats were divided into six groups,which were normal group,adriamycin group(15 mg/kg adriamycin，Group A),adenine group (200 mg·kg-1·d-1adenine，Group B),high-level adriamycin plus adenine group(15 mg/kg adriamycin+200 mg·kg-1·d-1adenine,Group C),medium-level adriamycin plus adenine group(10 mg/kg adriamycin+200 mg·kg-1·d-1adenine,Group D),and low-level adriamycin plus adenine group(5mg/kg adriamycin+200 mg·kg-1·d-1adenine,Group E).All the rats were underwent the injection of adriamycin via caudal vein and given adenine by gavage.The animals were harvested at 14th,28th,the urine,serum and tissue samples were collected.ResultsOnly the rats of normal group,group B,group E survived at 14th,28th day;the 24 h protein urine of group E were statistically higher than those in normal group and group B;the BUN,SCr in group E rats were statistically increased;the pathological changes such as interstitial fibrosis,glomerulosclerosis in group E and group B were more obvious compared to other groups.ConclusionThis method could establish a successful chronic renal failure with glomerular and tubulointerstitial injury,however,the optimal dosage still need to be investigated.

kidney failure,chronic；kidney glomerulus；animal model;adenine;adriamycin

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.004

四川省科技厅中西医结合肾脏病防治四川省青年科技创新研究团队(2011JTD0014)；泸州市科技基金资助项目(泸市科2010-128号)。作者简介：林佳如(1988-)，住院医师，在读博士，主要从事肾内科相关研究。△

，E-mail:junmingfan@163.com。

R332

A

1671-8348(2016)14-1882-04

2015-11-08

2015-12-27)